先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病两家系ABCA12基因突变分析

刘婷婷 杨发灯 林志淼 汪慧君 胡凌寒 钟伟龙 杨勇

100034北京大学第一医院皮肤科

先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病（autosomal recessive congenital ichthyosis，ARCI）是临床上表现为全身皮肤鳞屑为特征的一组具有异质性的皮肤疾病。主要分为板层状鱼鳞病（lamellar ichthyosis，LI）、先天性鱼鳞病样红皮病（congenital ichthyosiform erythroderma，CIE）、丑角样鱼鳞病（harlequin ichth⁃yosis，HI）三种亚型［1］。板层状鱼鳞病主要临床特征是大片深灰或棕色鳞屑、角化过度，无或轻度红皮病，而先天性鱼鳞病样红皮病表现为广泛分布小的白色鳞屑和程度不等的红皮病。丑角样鱼鳞病症状最严重，出生时新生儿全身紧密包裹胶样膜、亮红色渗血的皮肤裂口和皲裂、严重的睑外翻、唇外翻和耳部畸形，一般早产或出生后数日或数周内死亡。目前已证实的致病基因包括：TGM1、ALOX12B、ALOXE3、ABCA12、CYP4F2、NIPAL4、SDR9C7、LIPN、CERS3、PNPLA1、ST14、CASP14、ABHD5、SLC27A4、SULT2B1［1⁃5］，其中ABCA12 突变较少，约占5%［6］。ABCA12基因突变的病例主要集中在非洲、欧洲以及日本等地区，而我国相关报道较少。我们在临床中收集了两个ABCA12基因复合杂合突变的ARCI家系，进一步探究ABCA12基因突变与临床表型之间的联系。

资料和方法

1.临床资料：例1，男，23岁，出生时身体广泛发红伴火棉胶样改变，之后全身渐脱屑。体检：躯干、四肢及面部轻微红皮病症状伴白色细小鳞屑，双手屈曲伴轻度挛缩，皲裂性掌跖角化（图1A），诊断：轻型CIE。例2，女，30岁，早产，出生时全身皮肤发红、紧绷，伴睑外翻，后全身皮肤角化、脱屑，手指屈曲伴轻度挛缩。体检：全身广泛发红，游离片状白色鳞屑，双眼睑外翻，瘢痕性秃发，手指屈曲伴轻度挛缩，皲裂性掌跖角化（图1B），诊断：重型CIE。2例患者的父母均否认近亲婚配，否认家族有类似病史。

图1 先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病患者临床特征 1A：例1腹部及大腿轻微红皮症状伴白色细小鳞屑，手指屈曲伴轻度挛缩，皲裂性掌跖角化；1B：例2面部红斑、眼睑外翻、瘢痕性秃发，背部游离片状白色鳞屑，皲裂性掌跖角化，手指屈曲伴轻度挛缩

2.基因组DNA提取：经北京大学第一医院医学伦理委员会批准，并经2例患者父母签署知情同意书。分别取2例患者及其父母外周血2 ml，使用全基因组DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取基因组DNA。

3.基因芯片筛选可疑突变基因及位点：先使用Covaris打断法将样品DNA打碎至100～700 bp片段，再进行末端修复，加“A”及产物纯化，最后进行文库扩增PCR和质检，建库成功。经过生物素标记的探针（北京迈基诺基因科技股份有限公司）与文库DNA在一定条件下杂交，用链霉亲和素修饰的磁珠共价结合生物素标记的探针，抓取目的基因，用磁力架吸附携带目的基因的磁珠洗脱纯化，富集目的基因，再应用NextSeq 500高通量测序仪（美国Illumina公司）测序。对原始数据进行质量评估和去除衔接子、低质量reads（测序片段）及短序列（＜40 bp）等预处理，BWA比对软件将预处理后数据与人基因组（hg19）比对，再用GATK的Realigner Target Creator和Indel Realigner工具对Indel区域的reads重新做局部多序列比对，对碱基质量值经过矫正后，使用GATK的Haplotype Caller来检测SNP和INDEL。将得到的序列结果在数据库（包括千人基因组数据库、ESP6500、inhouse、外显子组整合联合数据库）中比对，对可疑的致病基因及突变位点进行筛选、标注，最后严格按照美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南进行致病性分析，找到可疑致病基因及突变位点。另外在分析中使用SIFT、Polyphen⁃2及Mutation Taster等软件进行功能预测。

4.Sanger法验证：通过primer blast网站，在ABCA12基因各个突变位点所在外显子的上下游设计引物，第21号外显子上游5′-GCATAACGACCCA TTTTCTTTGG-3′，下游5′-TGGTTGCCTACATGAAA GGTTCT-3′；47号外显子上游5′-ATCAAAGTCACT GACCACCATGA-3′，下游 5′-CACGGGCCAAGGAG TTTCTAA-3′；42号外显子上游5′-CTACTTGGTGC CTGTAGCGT-3′，下游5′-AGTCCTATTTGTGTCTAG GGGC-3′；50号外显子上游5′-TGCTCATGAACTTC AACCCAAG-3′，下游5′-TCCTTGAATCTGAGTGAG CACC-3′，引物由天一辉远生物科技有限公司合成，2例患者及其父母的DNA分别进行PCR反应，再用Sanger测序法进行双向测序（ABI3730xl测序仪，天一辉远生物科技有限公司）。测序结果包括目的外显子所有序列及两侧至少30 bp侧翼序列，纯化后的测序结果与Ensembl genome browse 90所公布的序列双向对比。

结 果

例1在ABCA12基因的21和47号外显子分别出现c.2759A＞G（p.N920S）和c.7004A＞G（p.Y2335C）复合杂合错义突变（图2A），其中c.2759A＞G突变来自母亲，c.7004A＞G突变来自父亲。例2ABCA12基因在42号外显子存在c.6163_6164insT（p.K2057Qfs*8）杂合移码突变，50号外显子存在c.7406G＞A（p.C2469Y）杂合错义突变（图2B），其母亲携带c.6163_6164insT突变，其父亲携带c.7406G＞A突变。使用SIFT，Polyphen⁃2及Mutation Taster软件对上述3个错义突变进行功能预测，结果均显示其可能的致病作用，另外1个移码突变c.6163_6164insT编码的截断蛋白也可能影响蛋白质功能（表1）。

图2 2例先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病ABCA12基因测序结果及突变位点 例1在21和47号外显子出现c.2759A＞G（p.N920S）和c.7004A＞G（p.Y2335C）复合杂合错义突变；例2在42和50号外显子存在c.6163_6164insT（p.K2057Qfs*8）杂合移码突变和c.7406G＞A（p.C2469Y）杂合错义突变

图3 ABCA12蛋白结构［8］及患者的突变位点 p.N920S位于N末端区域；p.Y2335C和p.C2469Y位于第2个核苷酸结合区域；p.K2057Qfs*8位于第2个跨膜区域中2和3号螺旋跨膜区之间。黑色的p.Y2335C、p.C2469Y已被报道，红色的p.N920S、p.K2057Qfs*8为新突变

表1 两个先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病家系ABCA12基因突变功能预测

讨 论

根据临床表现不同，ARCI可以分为三个亚型，但不同亚型患者表型会有一定重叠。即使同一亚型，ARCI随病程发展也会表现出不同程度的变化。本文2例患者，尽管都诊断为CIE，但除了具有相同的手指屈曲伴轻度挛缩、皲裂性掌跖角化特征外，例2在红皮病程度、鳞屑的形态和大小上比例1表现得更严重，而且还伴双眼睑外翻、瘢痕性秃发。因此，例1和例2分别诊断为轻型CIE和重型CIE。

ABCA12基因位于2号染色体（2q34），是ATP结合盒转运子超家族成员，可编码一种主要在角质形成细胞内表达的脂质转运蛋白。ABCA12蛋白主要由两个高度保守的核苷酸结合区域、两个保守的跨膜区域组成。核苷酸结合区域位于细胞内，包含Walker A、Walker B、Q、D、H-loop、ATP结合位点等元件，而每个跨膜区域由6个螺旋跨膜区组成［7］（图3）。ABCA12蛋白可利用ATP来转运包含神经酰胺在内的脂质通过细胞膜［8］，在颗粒层角质形成细胞中高尔基体向板层小体的脂质转运和表皮分化过程中发挥重要作用［9］。故该基因功能缺陷会导致板层小体的脂质转运障碍且降低颗粒层细胞间的脂质水平［10］。迄今，在外显子组整合联合数据库可发现100多个ABCA12基因突变，且不同位点ABCA12基因突变会引起不同程度的表型［11］。移码突变、无义突变、剪接突变及片段插入缺失的突变都会编码截断蛋白甚至完全改变氨基酸序列，从而严重地影响蛋白功能，导致严重的HI。纯合或复合杂合错义突变对蛋白功能干扰比较小，一般只会引起不同症状的LI和CIE。在ABCA12基因突变中，超过93%会导致严重的HI，只有5%～7%引起症状较轻的LI或CIE［1,12］。ABCA12基因突变与患者临床表型具有紧密联系，可通过研究ABCA12基因突变为ARCI患者及家庭提供遗传咨询。

本研究中，c.7004A＞G和c.7406G＞A已被报道与ARCI相关［7，11］，而c.2759A＞G、c.6163_6164insT在千人基因组数据库和外显子组整合联合数据库均未检到，为新发现的突变位点。p.Y2335C和p.C2469Y分别位于高度保守的第2个ATP结合结构域中ATP结合位点附近和末端部位，突变可能会干扰ATP结合。例1家系中发现，新突变位点c.2759A ＞ G（p.N920S）在UniProt与天冬酰胺N-连接糖基化修饰位点相关，当第920位天冬酰胺突变为丝氨酸时，使N-连接糖基化消失，可能会干扰ABCA12蛋白信号传导或正确折叠［13］，p.N920S很可能对ABCA12蛋白正常结构和功能产生一定影响。复合杂合错义突变p.N920S和p.Y2335C使例1出现比较典型的火棉胶婴儿，躯干、四肢及面部轻微红皮病症状伴白色细小鳞屑、皲裂性掌跖角化、手指屈曲伴轻度挛缩等特征，临床诊断为轻型CIE。例2家系中，新突变p.K2057Qfs*8位于第2个跨膜区域的2和3号螺旋跨膜区之间，其编码的截断蛋白因缺少部分氨基酸片段，会破坏ABCA12蛋白的完整性，突变功能预测得分1.000（Mutation Taster），其必然不利于正常蛋白功能。潘琼等［14］报道的1例HI中移码突变c.6167_6168insT（p.F2056Ffs*9）与本研究的c.6163_6164insT（p.K2057Qfs*8）作用相似，都可能较严重地影响该蛋白功能，但HI患者的另一个无义突变c.3673C＞T（p.R1225*）位于第25号外显子，使第1225位氨基酸由精氨酸变为终止密码子，导致蛋白翻译提前终止，即ABCA12蛋白的2个核苷酸结合区域和第2个跨膜区域完全缺失，它对ABCA12蛋白功能的影响远远大于例2的错义突变c.7406G＞A（p.C2469Y），所以移码突变 c.6167_6168insT（p.K2057Qfs*8）和无义突变 c.3673C＞T（p.R1225*）可能导致具有致死性的HI亚型［14］。本研究中的例2与例1相比可证明移码突变带来的影响比错义突变更严重，与已报道HI患者相比可证明无义突变具有更大危害性。不同ABCA12基因突变和ARCI临床表型具有紧密关联。

总之，本文确定了2个ARCI相关的ABCA12基因新突变c.2759A＞G和c.6163_6164insT，首先报道了天冬酰胺N-连接糖基化修饰位点相关的突变，分析了不同突变可导致不同的表型。对进一步明确ABCA12基因突变与ARCI临床表型之间的联系具有一定的意义，并且为这2个ABCA12基因突变相关ARCI患者及家庭的遗传咨询奠定了基础。