不同年限野生和人工种植黄芪的电泳图谱鉴别

张晓薇

（山西中医药大学，山西晋中030619）

黄芪是常用补气药，始载于《神农本草经》，是我国重要的传统中药材。黄芪为豆科植物蒙古黄芪［Astragalus membranaceus（fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao］或膜荚黄芪［Astragalus membranaceus（fisch.）Bunge］的干燥根，味甘，性微温，具有补气升阳、益卫固表、利尿消肿、托毒生肌之功效。黄芪是目前临床应用较为广泛、研究比较深入的中药之一，可用于治疗体虚自汗、久泻等［1］，黄芪还具有增强免疫系统、抗氧化、延缓衰老、改善心功能状态、抗病毒、抗癌等功效［2］。近年来黄芪的使用量大大增加，被用作养生保健品，市面上各种包装的黄芪也应运而生。究竟是选择根茎型的还是饮片型的，很多人无从下手。随着规范化种植的兴起，到底是选择野生的还是人工种植的，也是很多人纠结的问题。

关于黄芪化学成分研究的报道很多，但主要集中在黄芪多糖和黄芪苷类的研究，很少从分子生物学基因表达产物蛋白质的角度来进行研究，而中医学的证候学特征与细胞蛋白质整体动态变化有着内在联系。目前黄芪的栽培品种很多，因产地、栽培方法、生长环境和采收季节的不同，其成分及含量存在差异。黄芪是山西的道地药材，如何对不同时期和不同种植的黄芪进行科学的、整体的研究是当前面临的一个重要问题。本文利用SDS-PAGE技术，从蛋白质角度出发，对不同种植方式及不同年限的黄芪进行蛋白质指纹图谱分析，旨在为黄芪种植及功效提供一项新的评价指标。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

DYY-8C型电泳仪（北京六一仪器厂），DYCZ-24D型双垂直板电泳槽（北京六一仪器厂），离心机（北京医用离心机厂），数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），架盘天平（天津市天马仪器厂），数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），微量移液器，培养皿（直径120 mm），移液管。

1.2 药材与试剂

山西省浑源县千佛峪山人工种植2年生、8年生和10年生黄芪，关二乡野生的2年、8年、10年生黄芪。甘氨酸、丙烯酰胺、过硫酸铵、β-巯基乙醇、N，N亚甲基双丙烯酰胺、冰醋酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甲醇、盐酸、无水乙醇、四甲基乙二胺、考马斯亮蓝R-250、溴酚蓝等，以上均为国产分析纯，十二烷基磺酸钠（SDS）购自Sigma公司。

2 方法与结果

2.1 试剂的配制与凝胶的制备

上样缓冲液：1 mol/L Tris-HCl（Ph6.80）2.5 mL，β-巯基乙醇 1.0 mL，10%SDS 4 mL，甘油 2.0 mL，0.1%溴酚蓝 1.0 mL，ddH2O 3.5 mL。电泳缓冲液（PH 8.81）：Tris 6.0 g，甘氨酸 28.8 g，SDS 1.0 g 加ddH2O溶解，定容至1 000 mL。考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝 0.25 g，甲醇225 mL，冰醋酸 46 mL，ddH2O 225 mL。脱色液：甲醇50 mL、冰醋酸75 mL、蒸馏水875 mL配制而成。凝胶的制备：参照文献［3-4］进行。浓缩胶为5%，分离胶为12%。

2.2 样品液的制备

分别将上述药材打粉过40目筛，取药材粉末0.5 g，加入电泳缓冲液5.0 mL，超声提取35 min，移至离心管中，按3 000 r/min离心 15 min，静置30 min，取上清液加入等量上样缓冲液，混匀，在100℃沸水中加热5 min，以除去亚稳态聚合。

2.3 上样

用微量移液器分别吸取30 μL样品提取液，缓缓注入样品槽底部，样品上加入5 μL溴酚蓝指示剂［5-7］。

2.4 电泳

在电泳槽中加入电泳缓冲液，接通电源，电泳开始时电流15 mA，样品进入分离胶后，电流控制在30 mA。待示踪指示剂溴酚蓝距前沿约0.5 cm时，停止电泳，整个过程需4~5 h。

2.5 染色、脱色

取出胶板，放入考马斯亮蓝R-250染色液中，在室温下染色4~6 h，用蒸馏水冲去凝胶表面附着染料，再用脱色液脱色，反复更换脱色液至谱带背景清晰为止。

2.6 不同样品的电泳图谱

结果见图1。

2.6.1 人工与野生黄芪的SDS-PAGE图谱比较 从SDSPAGE电泳图谱位置、宽窄、数目、着色程度可以看出不同种植方式和不同年限的黄芪蛋白质电泳图谱有一定的差异。明显可以看出同样年限的黄芪，人工种植的颜色和条带数都高于野生，说明人工种植的黄芪蛋白质含量优于野生。不同年限的蛋白质含量随年限增加而增加。因此不建议在年限过短时间采摘，合理的采摘时间在8年以上比较好。

图1 不同年限及种植方式黄芪SDS-PAGE电泳图谱

2.6.2 不同年限人工种植黄芪的比较 从人工种植8年和10年的黄芪电泳图谱看，二者几乎一样。说明8年生的黄芪已经成熟，可以采摘，不用再浪费种植时间。从图谱看8年、10年与2年生的蛋白质谱带一致，但2年生蛋白质含量明显偏低，很多条带几乎无法观察到。说明2年生长期整体蛋白质营养状况欠缺，因此种植年限是决定黄芪质量的一个重要的指标。

2.6.3 不同年限野生黄芪的电泳图谱比较 不同年限野生黄芪的谱带数目基本一致，但2年生黄芪的谱带数目及颜色明显低于8年和10年生。而且8年生黄芪谱带的蛋白质含量较10年还高，10年生与8年生比较明显缺少一条次级带。可见野生黄芪年限太短，营养成分的蓄积不足，产品达不到优质；而种植时间过长，由于田间属于无序管理的状态，对产品质量也会有一定的影响。

通过以上实验证明，黄芪由于年限不同其蛋白质含量有明显的差异，基本规律是8~10年生黄芪的蛋白质含量高，质量好。这也与好的黄芪都是10年左右的说法相符。有资料表明，2年生黄芪的氨基酸含量最低［8］。对于野生黄芪而言，如果年限过长，由于处于无人管理状态，它的一些组织有可能会破坏、堵塞、老化、抗性降低，从而使有效成分含量降低，上述实验也证明了这个理论。故建议采挖黄芪时应选择适宜的时期，不宜过早，亦不宜过迟，否则会影响黄芪药材的质量。

3 讨论

从上述实验结果看，人工种植的黄芪在蛋白质含量上要略优于野生。究其原因可能是由于人工种植黄芪进行了规范化管理，所以黄芪实心，而且皮薄光滑。野生黄芪由于没有人及时进行整理，造成黄芪根多、细，错乱分支较多，少有粗壮的，如果采摘不及时有可能出现空心、黑心。目前养生人士多用黄芪切片泡水，人工黄芪切片实心，泡茶会沉入水底，口感略有甜味。野生黄芪泡茶浮于水面，且没有种植的甜。由于黄芪饮片都是斜切，较难辨别人工、野生及年限，因此需要通过一些简单的方法来对市面上的产品进行甄别，利用SDS-PAGE电泳图谱对黄芪的品质做出判断简单易行。

蛋白质是生命的物质基础，在植物的发育过程中不同组织和器官在功能上的分化也表现在蛋白质的组成和数量的差异上［9］，因此蛋白质组成是动态的，所体现的蛋白谱带也就不同，故可以作为对不同年限植物生长的一个鉴定指标。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，由于电泳图谱在相同条件下表现出较好的重现性，可作为鉴别、比较和质量控制的依据，也为道地药材的科学种植等相关研究提供有利的科学依据。同时可建立中药蛋白质组学指纹图谱，在分子水平上丰富整个中药指纹图谱研究体系。