烧伤膏细菌内毒素检查方法学研究

曹霞飞 何华红 吴 婷 李志芳

1.广州市食品检验所，广东广州 511405；2.广州市药品检验所，广东广州 510160

湿润烧伤膏是一种用于各种烧、烫、灼伤的局部给药制剂，起到清热解毒、止痛、生机的作用，其组分中含有黄连、黄柏、黄芩等多种中药成分[1-3]。《中国药典》明确规定，用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定[4-6]，且应严格控制其中的内毒素含量。目前《中国药典》尚未收载该品种的内毒素检查法。本文对该供试品细菌内毒素检查方法进行探讨，建立可行性方法，为该品种质量标准的完善和提高提供实验依据。

1 材料与试剂

1.1 仪器

MS-1型自动漩涡震荡器（德国IKA）；TW12型六孔水浴箱（日本Julabo）；LK164-03型内毒素定量仪（美国Lab Kinetice Ltd.）；XS204型分析天平（美国 Mettler Toledo.）。

1.2 试剂

湿润烧伤膏：批号20140704，汕头美宝制药有限公司。鲎试剂（TAL）：批号1309222，湛江安度斯生物有限公司；批号13030612，福州新北生化工业有限公司；细菌内毒素标准品：中国药品生物制品检定所，批号150601-201377，规格70EU/mL；细菌内毒素检查用水（BET水）：湛江安度斯生物有限公司，批号1303290，规格50mL/支。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核试验[6-7]

按照2015年版《中国药典》（四部）通则细菌内毒素检查法规定，进行鲎试剂的标示灵敏度复核。取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。按细菌内毒素工作标准品的使用说明书，用移液管加入1mL的细菌内毒素检查用水，溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置自动漩涡混合器上混合30min，即为70EU/mL内毒素标准溶液。然后再稀释制成 0.5、0.25、0.125和 0.06EU/mL 四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s。具体的稀释过程如下：取0.4mL内毒素标准溶液加上3.6mL BET水即为1∶10稀释液，得到7EU/mL内毒素标准溶液。取1mL的1∶10稀释液，加上6mL BET水即为1∶70稀释液，得到1EU/mL内毒素标准溶液。取4mL的1∶70稀释液，加上4mL BET水即为1：140稀释液，得到0.5EU/mL内毒素标准溶液。取5mL的1∶140稀释液，加上5mL BET水即为1：280稀释液，得到0.25EU/mL内毒素标准溶液。取6mL的1∶280稀释液，加上6mL BET水即为1∶560稀释液，得到0.125EU/mL内毒素标准溶液。取2mL的1∶560稀释液，加上2mL BET水即为1∶1120稀释液，得到0.06EU/mL内毒素标准溶液。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果

取灵敏度标示值λ=0.25EU/mL的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1mL BET水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡。将已充分溶解的待复鲎试剂18支放在试管架上，其中16管分别加入0.5、0.25、0.125EU/mL和0.06EU/mL四个浓度的内毒素标准溶液，2支加入BET水作为阴性对照。内毒素标准溶液和BET水的加样量均为0.1mL/支。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入（37±1）℃的恒温器中，保温（60±2）min。见表1。

3批鲎试剂复核结果λc均在0.5λ-2λ范围，均可用于细菌内毒素检测。

2.2 内毒素限值（L）确定

中国药典2015版四部通则的细菌素检查法关于内毒素限值的确定：湿润烧伤膏临床使用为外用。涂于烧、烫、灼伤等创面（厚度薄于1mm），每4～ 6h更换新药。烧伤膏的密度[8]ρ≈1.0g/mL，按人体表面为1.6m2，假设极端情况患者全身涂满厚度为1mm的湿润烧伤膏，计算得到体积：

为了保证湿润烧伤膏用药安全，根据药典中注射剂K=5EU/mL，湿润烧伤膏的K值参考最严格的注射剂限制，即取湿润烧伤膏K=5EU/mL。则：

按1g湿润烧伤膏与2mL正己烷的比例溶解，再用细菌内毒素检查用水（与正己烷按1∶1比例）充分振荡混匀，萃取水相，故其水相的细菌内毒素限值相当于：

2.3 烧伤膏萃取液中细菌内毒素回收率试验[9-11]

2.3.1 标准曲线溶液的制备 取细菌内毒素工作标准品1支，加入细菌内毒素检查用水1mL，制成70EU/mL的溶液，密封后，置自动漩涡混合器上振荡30min后取下，用细菌内毒素工作标准品溶液，制成 10EU/mL、1.0EU/mL、0.1EU/mL 3 个浓度的稀释液，每一浓度做3支平行管。同时用BET水与鲎试剂反应作为阴性对照。

2.3.2 供试品溶液的制备 取湿润烧伤膏2.25g，加入4.5mL正己烷，放入自动漩涡混合器上振荡（频率2000r/min，时间2min），再加入4.5mL细菌内毒素检查用水继续萃取。静止使之分层后，取萃取液到另一支试管中备用，即样品空白溶液C0。

将细菌内毒素标准品复溶（规格：70EU/mL），加入内毒素检查用水，分别稀释制成45EU/mL、9EU/mL的待接种液。取一定量的烧伤膏，经正己烷萃取后，按一定比例分别加入接种液，以上每一步骤均需混匀，再以2000r/min，继续萃取2min，制得终溶度为1.0、0.5、0.3EU/mL供试品溶液，静止使之分层后，取萃取液标记为 C1.0、C0.5、C0.3。

2.3.3 标准曲线的可靠性验证 根据《中国药典》细菌内毒素动态显色法的规定，阴性对照的反应时间＞3600S，且大于标准曲线最低浓度反应时间（749.67S），变异系数（CV）≤10%。将全部数据进行线性回归分析，得回归方程为：LgTg=2.7676-0.1064LgC。相关系数R=-0.9997，∣R∣＞ 0.980，见表2。标准曲线成立，试验有效。

表2 动态显色法标准曲线的可靠性试验结果（n=3）

2.3.4 不同接种浓度供试品的回收率比较 为证明样品中所含内毒素能否完全被萃取至待检测水溶液中，接种一定量的内毒素标准品[12]，使外加内毒素标准的终浓度为1.0、0.5及0.3EU/mL，通过动态显色法，分别对其进行回收率试验验证，看其回收率是否在50%～200%范围内。分别向上述各管中加入动态浊度法鲎试剂0.1mL，每个浓度设2孔，另取2孔加入0.1mL细菌内毒素检查用水作为阴性对照。振荡混匀后放入动态试管检测仪，于(37±1)℃，波长405nm处测定各浓度的反应时间，并自动计算出供试品的内毒素含量及回收率。见表3。

表3 动态显色法测定结果（n=2）

按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量ct和cs，该试验条件下的回收率（R）计算见式：

样 品 C1.0的 回 收 率=（2.6311-0.0020）/1.0=262.91%；样品C0.5的回收率=（0.0142-0.0020）/0.5=2.44%；样品C0.3的回收率=（0.1590-0.0020）/0.3=52.3%；样品C0.3的回收率细菌内毒素的回收率为52.3%，在50%～200%之间。

2.4 水相萃取液凝胶法干扰试验

2.4.1 有效稀释倍数 湿润烧伤膏经萃取后的水相溶液的最大有效稀释倍数（MVD）：是指在试验中湿润烧伤膏经萃取后的水相溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。MVD=cL/λ（L为供试品的内毒素限值；c为湿润烧伤膏萃取液浓度，当L以EU/mL表示时，则c等于1.0ml/mL；λ为在鲎试剂的标示灵敏度。）试验用鲎试剂灵敏度λ在0.25～0.03EU/mL。则萃取液对应的有效稀倍数计算见式：

MVD0.25=0.375/0.25=1.5倍；MVD0.125=0.375/0.125=3倍；MVD0.06=0.375/0.06=6倍；MVD0.03=0.375/0.03=12倍。

2.4.2 干扰预试验 将湿润烧伤膏萃取液用细菌内毒素检查用水分别稀释1.5、3、6、12倍，将此系列浓度的溶液记为NPC。

同时在上述溶液中加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有2λ（即0.5EU/mL）浓度的细菌内毒素，记此系列溶液为PPC。取灵敏度为0.25EU/mL的两个不同厂家的鲎试剂，分别将NPC和PPC进行反应，每一浓度重复两管。并设阳性和阴性对照。见表4。

表4 水相萃取溶液的干扰预试验结果

由以上水相萃取溶液的干扰试验预试验结果可以初步了解：湛江安度斯生物有限公司对水相萃取液的细菌内毒素的试验结果均无干扰；福州新北生化工业有限公司对水相萃取液的细菌内毒素的试验结果在进行6倍及以下稀释浓度无干扰。

2.4.3 水相萃取溶液的凝胶法正式干扰试验 为了最终确定湿润烧伤膏经萃取后的水相溶液是否存在干扰因素的影响，再进行正式干扰试验。用灵敏度为0.25EU/mL，两个不同厂家的鲎试剂按中国药典2015年版四部通则的细菌内毒素检查法进行试验，取萃取液（6倍稀释），用BET水和供试品稀释液将对应的细菌内毒素工作标准品稀释成2λ，λ，1/2λ和1/4λ浓度的PPC系列和供试品稀释液NPC系列，每一稀释浓度平行4管，同时用上述供试品稀释液和BET水各做两管阴性对照管，按公式计算BET水和供试品稀释液反应终点浓度的几何平均值（Es和 Et），Es=lg－ 1（Xs/4），Et=lg－1(Xt/4)，见表 5。

其中系列溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）计算见式：

式中Xs和Xt分别为系列溶液的反应终点浓度的对数值（lg），故：

正式干扰试验结果表明：Es1 和Es2均在0.5λ ～ 2λ（包 括 0.5λ 和 2λ） 及 Et1在 0.5 Es1：2 Es1（包 括 0.5 Es1和 2 Es1）和 Et2在 0.5 Es2～2 Es2（包括0.5 Es2和2 Es2）范围之内，确认水相萃取溶液（6倍稀释）无干扰影响。

3 讨论

湿润烧伤膏为脂溶性药物[4]，由于鲎试剂与内毒素的反应一般都是在水溶液中进行[13]，而湿润烧伤膏不溶于水，因此不能直接进行细菌内毒素检查。国外实验室已进行过前期研究证明，正己烷是油脂类合适的溶剂[14]。利用细菌内毒素可溶于水的特性，对湿润烧伤膏，先用正己烷溶解后，再与细菌内毒素检查用水充分振荡混匀，取水相萃取液进行细菌内毒素检查。对此方法我们重点考察了两方面：首先，考察样品处理过程中内毒素的回收率，否则对水相溶液进行内毒素检查不能准确反映样品中的内毒素含量。且考虑不同浓度的内毒素在油相和水相溶液中的分配比例可能不同，其回收率存在差异，因此采用浊度法对外接种内毒素多种浓度进行回收率试验比较。本研究在国外实验室研究[15]的基础上确证了烧伤膏水相萃取液稀释6倍及以下浓度无干扰；外加接种0.3EU/mL内毒素回收率为52.3%，符合中国药典动态浊度法回收率50%～200%范围内。另两个接种浓度（1.0及0.5EU/mL内毒素）的回收率分别为262.89%及2.4%，结果不太理想，原因需做进一步探究。其次，尽管脂溶性药物中的药物和辅料均难溶于水，但萃取后的水相溶液可能含有药物和辅料，应验证萃取后水相溶液对鲎试剂与内毒素的凝集反应有无干扰作用，这便是我们进行干扰试验的目的。实验结果验证了6倍稀释浓度的水相萃取液对两个厂家生产的鲎试剂均无干扰作用，Es/Et均在0.5～2.0范围之内。

综上所述，湿润烧伤膏可以使用细菌内毒素检查法进行检测，本研究推荐使用动态浊度法鲎试剂对供试品的6倍稀释液作内毒素检测，供试品对试验无干扰。为下一步制定烧伤膏的细菌内素检查方法提供了有力证据。