国内外HER-2/neu基因扩增型胃癌临床病理及预后特征分析

黄秀芳 原向伟 刘琼茹 梁津杰 方晓华 蔡育波 杨文丽 黄 辉 陈艳虹 陈仙兰张 鑫,3 林碧华

1.广东省江门市中心医院病理科，广东江门 529030；2.广东省江门市中心医院脊柱骨科，广东江门 529030；3.广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 523808；4.广东医科大学生物化学与分子生物学教研室，广东东莞 523808

胃癌（gastric carcinoma）是常见的消化道恶性肿瘤，其中胃腺癌最为常见，可占85%以上[1-2]。世界新发胃癌的患者，一半以上位于我国[3]，由于早期症状不典型，普查不及时，我国早期胃癌的诊断率不足10%，5年生存率较低[4-5]，可见我国胃癌防治的严峻，深入研究胃癌的发生机制，寻找更为有效的诊断标记物及潜在的治疗靶点意义重大。曲妥珠单抗（Trastuzumab）在人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2， HER-2）阳性胃癌分子靶向治疗过程中的疗效已明确，荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）技术是检测HER-2/neu扩增的金标准，也是重要的胃癌伴随诊断项目[6]。虽然HER-2/neu扩增可指导患者用药，但HER-2/neu扩增的胃癌患者中，其临床病理特征及预后仍有争论。本文利用癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）的数据和我院胃癌患者数据进行比较，探索HER-2/neu扩增与胃癌临床病理特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 TCGA胃腺癌数据下载

参考文献[7-8]，在R语言软件平台（v3.2）上通过TCGAbiolinks程序的GDCquery函数下载癌症基因组图谱中胃腺癌的基因组拷贝数信息（由Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片过滤得到）及对应样品的临床信息；利用GDCprepare_clinic函数输出整理各患者的病理临床信息。数据库的更新下载日期为2018年5月31日，基础信息较为完整的有效患者数为441例。

1.2 全基因组拷贝数变异分析

参考文献[9-11]，在GenePattern公共服务器平台（https：//genepattern.broadinstitute.org/），利用 GISTIC 2.0软件分析各组肿瘤样品的全基因组拷贝信息，参考基因组为人类19版基因组（human genome 19，hg19），探针标记的物理位点信息（Markers file）和CNV参照信息（CNV file）均整理自SNP Array 6.0的第 35版本信息（http：//www.affymetrix.com/）；关键的运行参数均为默认，并分析HER-2/neu基因（ERBB2）的拷贝数变异情况。

1.3 临床资料

选择2008年1月～2014年12月，在我院进行手术切除的胃癌标本404例，术前或活检前均未接受放、化疗及免疫治疗，所有标本均经病理学明确诊断为胃腺癌。三组数据集的一般临床病理信息比较见表1。

1.4 FISH法检测HER-2/neu基因扩增水平

HER-2/neu基因检测试剂盒购自广州达安基因股份有限公司（国械注册20153402099），操作步骤及判读标准参考说明书。根据病理医师选定的检测区域在蜡块上做标记，按4.0μm石蜡切片，65℃烤片1h；二甲苯室温脱蜡，逐级酒精水化，超纯水浸泡3min，沸水煮片20min；蛋白酶K反应液覆盖组织，37℃消化5min，过2×SSC缓冲液，逐级酒精脱水；探针杂交液覆盖组织，加盖盖玻片，橡皮胶水封边，85℃变性5min，37℃避光杂交过夜；孵育结束后，过2×SSC缓冲液，过0.1% NP-40/2×SSC缓冲液，70%乙醇脱水3min，滴加DAPI染液，加盖盖玻片，荧光显微镜观察计数，并参考文献[12]进行判读。

1.5 统计学方法

计数资料用频数表示，用Excel 2010及GraphPad Prism 5.0软件处理数据，各组间频数数据（2×2频数表）统计使用χ2检验（Chi-squared test）或Fisher’s精确检验（Fisher’sexact test），生存分析使用Kaplan-Meier分析、Log-rank检验，检验水平α=0.05。

2 结果

2.1 一般临床病理信息比较

比较TCGA数据库与我院患者一般临床病理信息，可知两群患者在年龄（χ2=30.082，P＜ 0.001）、T分期（χ2=46.662，P＜0.001）和N分期（χ2=27.073，P＜0.001）的分布中有差异，在性别、病理分级、M分期及临床分期中的分布无差异。

2.2 HER-2/neu基因扩增情况

TCGA数据库中，HER-2/neu基因扩增65例，占全部患者的14.7%；我院HER-2基因扩增69例，占全部患者的17.1%，两组数据分布无统计学差异（χ2=0.865，P=0.352）。

2.3 HER-2/neu基因扩增与胃癌临床病理学特征间关系

TCGA数据库和我院样品中，男性HER-2/neu扩增率高于女性，差异均具显著性（χ2=5.165，P=0.023及χ2=4.127，P=0.042）；低、中病理分级的 HER-2/neu

扩增情况明显高于高病理级别，差异均具显著性（χ2=11.314，P＜0.001及χ2=7.121，P=0.008）。此外，不同年龄、T分期、N分期、M分期及临床分期的胃癌HER2阳性率均无统计学差异，见表2。在性别、年龄、病理分期及TNM分期中，HER-2/neu扩增分布在TCGA数据库与我院样品间差异无统计学意义。

表1 TCGA及江门市中心医院胃癌患者的基本信息

表2 TCGA及江门市中心医院胃癌患者的基本信息

2.4 HER-2/neu基因扩增与胃癌患者预后间关系

TCGA数据库和我院胃癌患者生存曲线的对比，见图1，其中HER-2/neu扩增患者的中位生存时间是26.4个月和38.8个月，HER-2/neu非扩增患者的中位生存时间是29.4个月和39.1个月，两群患者的生存预后差异无显著性（P=0.170和P=0.602）。

图1 TCGA胃癌患者生存预后情况

3 讨论

HER-2/neu的编码基因（又称 ERBB2），位于人染色体17q21，编码185kD的I型跨膜酪氨酸激酶，其基因扩增存在于乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结直肠癌和肺癌等恶性肿瘤[13-14]。HER-2/neu在胃癌及胃食管结合部癌的阳性率为4.4%～53.4%，均值为17.9%[15]； TCGA数据库中，HER-2/neu的阳性率为14.7%，我院样品HER-2/neu的阳性率为17.1%，两组数据差异无显著性，均符合文献报道[15-16]，表明国内外胃癌中HER-2/neu的扩增情况较为一致。

HER-2/neu的扩增和过表达，可通过磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B， PKB，又 称 Akt）及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPK）途径影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、粘附、分化及浸润等[17]。乳腺癌中HER-2/neu的扩增明确与差的病理临床特征相关[13]，但在胃癌未见统一的结果。本研究显示，在TCGA数据库和我院样品中，HER-2/neu的扩增与患者的年龄、T、N、M分期及临床分期均不相关，但男性患者HER-2/neu扩增率高于女性；低病理级别胃癌HER-2/neu扩增率显著高于高级别的胃癌，表明HER-2/neu扩增与男性及胃癌高分化程度相关，符合文献报道[18]，提示男性、分化较好的胃癌是曲妥珠单抗治疗的主要人群。

HER-2/neu扩增是胃癌重要的预后因素，HER-2/neu扩增患者的5年生存率较非扩增低，是胃癌患者预后的独立检测指标[19]；也有文献报道[20]，HER-2/neu的扩增与患者总生存时间及无复发生存时间均无关系。我们发现HER-2/neu的扩增情况不能区分患者的总生存时间，表明在综合临床分期、病理分级和靶向HER-2药物使用情况下，HER-2/neu的扩增不能作为判断患者预后的关键因素。是否在特定临床分期、病理分级及治疗手段下，HER-2/neu的扩增能作为胃癌患者预后判断指标，这需要我们进一步的研究。