人甲状腺乳头状癌中微小RNA-381-3p低表达及其临床意义探究*

孔 伟 李萍萍 孔歉歉 张新焕 王 艺 王庆宝

(泰山医学院附属医院，山东 泰安 271000)

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，占女性癌症的5%～10%[1]。甲状腺癌中，70%～80%是乳头状癌(PTC)，大多数PTC通过根治手术、TSH抑制治疗及放射性碘治疗可以使患者长期无病生存，但是仍有大约10%的患者出现复发或转移，预后较差[2-3]。深入了解人类PTC的发生、发展和进展的潜在机制，能够为PTC的治疗提供更好理论依据。

微小RNA(miRNA)是一类短链，内源的，非编码RNA，长度为18～25个核苷酸[4]。越来越多的证据表明miRNA影响多种生物学过程，尤其是恶性肿瘤的发生和发展[5]。随着微阵列技术在miRNA表达谱中的应用，在各种肿瘤中鉴定出越来越多的异常表达的miRNA[6]。大量功能实验表明，miRNA根据其靶基因[7-9]的作用起到肿瘤抑制基因或癌基因的作用。据报道miR-381-3p基于肿瘤类型[10-12]作为致癌或抑制肿瘤的miRNA。然而，miR-381-3p在PTC中的表达和功能尚未见报道。本研究旨在通过检测人甲状腺乳头状癌中miR-381-3p的表达情况，探究miR-381-3p在人甲状腺乳头状癌发生、发展和进展中的可能作用及其临床意义。

1 材料与方法

1.1研究对象

收集从2017年2月到2018年2月在泰山医学院附属医院甲状腺外科手术的129例PTC患者的甲状腺乳头状癌组织(Tumer组)和癌旁组织(Normal组， 距甲状腺癌组织 2～3 cm) ，获得样本被立即冷冻并储存在液氮中。该研究得到了泰山医学院附属医院研究伦理委员会的批准，并获得了所有患者的书面知情同意书。

1.2RNA提取和RT-PCR

通过TRIzol试剂(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)提取来自组织样品的总RNA。根据使用说明，使用RNeasy微型试剂盒(中国北京海淀Qiagen)对RNA进行纯化。用QuantiTect SYBR qPCR试剂盒(Qiagen，Haidian，Beijing，China)采用RT-qPCR法对 miR-381-3p表达量进行检测，同时设置双复孔保证检测可靠性。miR-381-3p 、GAPDH(内参)引物见表1，反应体系见表2。

表1 miR-381-3p 、GAPDH引物序列

表2 PCR反应体系

取各个样本的 c DNA 及其相对应的引物按照以上方法混合，然后进行PCR扩增，收集荧光信号，进行熔解曲线分析。反应条件: 95 ℃ 条件下，预变性 2 min，接着40个循环，95 ℃ ，5 s； 冷却到 60 ℃，34 s， 68 ℃，30 s；反应结束后由系统自动使用2-ΔΔCt方法计算相对基因定量结果，每个样本重复 3 次。

1.3统计分析

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。miR-381-3p表达情况的比较采用t检验。对危险因素进行分层比较，miR-381-3p表达水平采用Mann-Whitney U检验。P≤0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1以GAPDH为内参，用特异引物对miR-381-3p进行扩增后，结果显示其在 PTC组(Tumer)中表达量明显低于癌旁组织(Normal)组(P=0.015)(表1、图1)。

表3 PTC 患者癌旁组织(Normal组)与癌组织(Tumer组) miR-381-3p表达水平

2.2从表4可以看出，miR-381-3p的表达水平与PTC 患者的年龄(图2)、性别(图3)无显著相关性，而肿瘤大小(图4)、是否发生腺外侵犯(图5)及是否淋巴结转移(图6)有显著相关性。

图2 不同年龄组Ct值

图3 不同性别组Ct值

图4 不同肿瘤大小组Ct值

图5 是否腺外侵犯组Ct值

图6 是否淋巴结转移组Ct值 表4 miR-381-3p表达水平与 PTC患者 临床特征的相关性分析

临床特征患者数miR-381-3p表达水平P值年龄 <55岁834.018±1.7420.048 ≥55岁464.622±1.534性别 男614.274±1.5410.772 女684.197±1.823肿瘤大小 ≤2cm844.648±1.6560.000 >2cm453.460±1.482腺外侵犯 否1074.509±1.6440.000 是222.891±1.222淋巴结转移 否1034.549±1.6520.000 是262.985±1.206

3 讨 论

近年来，miRNA由于具有多种生物学功能而成为研究的热点。识别与肿瘤发生有关的特异性miRNA及其靶点对于PTC的预防和治疗具有重要意义。在本研究中，我们发现miR-381-3p在PTC组织中的表达明显下调，其表达水平与年龄、性别无关，而与肿瘤大小、淋巴结转移及腺外侵犯呈负相关。因此，我们推测miR-381-3p表达下调与PTC生长、肿瘤增值及侵袭有关。

Cao等[13]发现，上调miR-38-3p的表达，可能使胃癌预后良好，并通过靶向TMEM16A抑制了细胞增殖和侵袭。Zhang等[14]报道miR-381-3p在肝细胞癌中低表达，其强制表达通过靶向肝受体同系物-1抑制了细胞的生长和侵袭。Yang等[15]还建议使用miR-381-3p作为肿瘤抑制因子，直接靶向FGFR2抑制口腔鳞状细胞癌的增殖。相反，在骨肉瘤和胶质瘤中，miR-381-3p的表达上调，成为肿瘤的启动子[16]。这些发现表明，miR-381-3p在癌症中的作用仍然存在争议。据我们所知，miR-381-3p在PTC中的表达和功能尚未见报道。我们研究实验表明miR-381-3p在PTC中的表达下调，提示miR-381-3p可能为治疗甲状腺乳头状癌的新靶点。

探究miR-381-3p的表达变化与甲状腺乳头状癌的相关性，有助于揭示甲状腺乳头状癌的病因及分子机制，有助于揭示甲状腺乳头状癌侵袭相关的分子机制，有可能为甲状腺乳头状癌早期诊断提供新的标志物，同时为甲状腺癌的鉴别诊断治疗提供新的分子标记物。