PAX6基因rs667773和rs3026354位点多态性与精神分裂症临床症状的相关性研究*

丁 玉 杨建立 韩海斌

精神分裂症（Schizophrenia）是精神科常见的病因未明的精神疾病，与精神分裂症相关的诸多研究假说中，神经发育异常假说与精神分裂症关系密切［1，2］。假说表明早期脑部损伤历经了正常的神经发育过程后若附加应激刺激，可能会导致精神分裂症的发病［3，4］。有研究表明PAX6基因在大脑神经发育中有着重要作用，PAX6基因突变或缺失会影响海马神经发生，对精神分裂症患者的研究也发现，精神分裂症患者的海马神经发生异常［5～7］。PAX6基因被敲除的鼠会出现类似精神分裂症样的表现，人类与啮齿动物的PAX6基因编码区域具有高度相似性［8～10］。本研究采用病例对照的研究方法，进一步分析PAX6基因2个单核苷酸多态性（SNPs）位点多态性与精神分裂症的发病机制及相关临床症状间是否存在关系。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2012年5月～2013年5月在天津市安定医院接受系统治疗的首发精神分裂症患者纳入患者组。符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版（DSM－IV）精神分裂症的诊断标准，由2名以上精神科医师独自完成，患者治疗前用阳性和阴性综合征量表（PANSS）评定相关临床症状。共入组262例，其中男145例，女117例；汉族；年龄18～45岁，平均（29.4±6.5）岁；右利手。对照组选取与患者组各方面相匹配的健康志愿者318名，其中男187名，女131名；汉族；年龄18～45岁，平均（30.3±6.7）岁；右利手。一般健康问卷各项目总分＜30分，需排除家族中有精神疾病及自杀者，入选个体之间无血缘关系。两组均排除脑器质性疾病及其他躯体疾病病史，排除精神活性物质滥用或依赖史，研究对象均来自中国淮河以北。入组患者的监护人及健康志愿者在了解本研究以后，签知情同意书。两组性别、年龄的分布比较差异均无统计学意义（P＞0.05），证实本研究中两组研究对象的性别及年龄匹配。

1.2 方法

1.2.1 标本收集与基因组DNA提取 对符合入选标准的对象，择时采肘静脉血10 ml，用EDTA作为抗凝剂进行充分抗凝，离心后放置于－80℃低温冰箱保存，为提取DNA备用。本研究提取人类基因组DNA采用的是AXYGEN公司的AxyPrep-96全血基因组DNA试剂盒。

1.2.2 单核苷酸多态性（SNPs）位点选择、引物及探针设计合成 仔细检索HapMap数据库查找PAX6基因34 kb相关的区域，挑选位于PAX6的3’非翻译区的2个标签SNPs位点rs667773、rs3026354。遗传标记确定之后，使用Primer Premier 5 PCR引物设计程序设计引物，每个连接酶检测反应（LDR）位点均需设计3条探针，可以和特异性探针相链接进而更好地识别该位点的等位基因。

1.2.3 基因组DNA聚合酶链式反应（PCR） 扩增SNP位点所在的片段，在PCR扩增产物中加入等体积ddH2O稀释，作为连接反应的模板，准备连接反应MIX体系 （10μl）。在 Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600上设置程序：95℃变性 2 min，94℃ 30 s、50℃2 min（35个循环）。各取1μl ABIGS-500 ROX荧光标记分子量标准、1μl去离子甲酰胺上样液和1 μl LDR连接产物混合，95℃加热变性2 min后放置在冰中骤冷；在5 mol／L尿素和5%聚丙烯酰胺中进行3 000 V电泳2.5 h，应用Genemapper软件进行相关的基因分型及数据处理。将剩余的样品继续放置于－20℃保存。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件包进行数据的统计和分析。采用SHEsis遗传分析软件进行H-W平衡检验，采用χ2检验进行组间基因型和等位基因分布频率比较；本研究将检验水平定为P＜0.05。采用方差分析对rs667773、rs3026354位点各基因型PANSS量表评分进行比较。

2 结果

2.1 基因型与等位基因分析

2.1.1 Hardy-Weinberg平衡检验 患者组和对照组SNPs rs667773基因分布都符合H-W平衡定律（χ21＝0．026，P1＞0．05；χ22＝3．327，P2＞0．05），患者组和对照组SNPs rs3026354基因分布也都符合H-W平衡定律（χ21＝1．116，P1＞0．05；χ22＝1．403，P2＞0.05），证实本研究的样本有群体代表性。

2.1.2 两组SNPs rs667773、rs3026354基因型、等位基因频率分布 患者组和对照组rs667773基因型及等位基因的分布频率比较，差异无统计学意义（基因型：χ2＝2．333，P＞0.05；等位基因：χ2＝0．096，P＞0．05）。患者组和对照组rs3026354基因型及等位基因的分布频率比较，差异有统计学意义（基因型：χ2＝9．316，P＜0.05；等位基因：T＞C，χ2＝8．371，P＜0．05）。见表1、表2。

表1 两组SNPs rs667773位点基因型及等位基因分布比较［n（%）］

表2 两组SNPs rs3026354位点基因型及等位基因分布比较［n（%）］

2.1.3 SNPs rs667773、rs3026354位点的连锁不平衡（LD）分析 对SNPs rs667773、rs3026354两个位点的LD情况进行分析结果为D’值为1，r2值为0.861，显示这2个位点间有着很强的LD。对2个位点构成的单体型分析结果表明，患者组和对照组之间的单体型rs3026354C／rs667773T，rs3026354T／rs667773T频率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 SNPs rs667773、rs3026354位点与精神分裂症临床症状分析

2.2.1 患者组SNPs rs667773不同基因型患者的临床症状分析 通过比较患者组SNPs rs667773位点不同基因型PANSS阳性症状分、阴性症状分和一般精神病理因子分，显示评分差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 患者组SNPs rs667773位点不同基因型的临床症状分析（）

表3 患者组SNPs rs667773位点不同基因型的临床症状分析（）

PANSS CC CT TT F值 P值阳性症状 20.70±4.35 21.61±4.71 22.00±3.24 1.367 0.257阴性症状 24.23±6.69 24.73±6.95 22.89±6.19 0.359 0.699一般精神病理因子 40.23±7.17 40.17±5.97 38.44±7.58 0.290 0.748

2.2.2 患者组SNPs rs3026354不同基因型的临床症状分析 通过比较患者组的SNPs rs3026354位点不同基因型PANSS阳性症状分、阴性症状分和一般精神病理因子分，结果显示阴性症状评分差异有统计学意义（P＜0.05），其中 TT型高于 CC型和 CT型（P＜0.05）。见表 4。）

表4 患者组SNPs rs3026354位点不同基因型的临床症状分析（

表4 患者组SNPs rs3026354位点不同基因型的临床症状分析（

注：与TT型比较，*P＜0.05

PANSS CC CT TT F值 P值阳性症状 20.94±4.06 20.98±4.52 21.06±4.48 0.013 0.987阴性症状 22.76±3.87*23.37±4.61*25.14±4.23 4.656 0.021一般精神病理因子 39.88±7.35 40.07±6.60 40.97±7.82 0.551 0.577

3 讨论

目前精神分裂症（Schizophrenia）已发展成全球社会经济负担最重的疾病之一，可表现为情感思维及行为的分裂，个体精神活动和周围环境不协调，有研究表明，在所有精神分裂症患者中，大部分会出现多个阴性症状，相对于幻觉妄想等阳性症状来说，阴性症状对患者的预后更为重要［1，2］。相关调查报告显示，该病在不同地区和不同国家的发病率比较接近，全世界大约有0.5% ～0.8%的人口患有该疾病［11，12］。研究表明若患者在幼年大脑髓鞘形成期发生神经发育异常可能会产生精神分裂症的症状［13］。随着神经发育假说研究的进展，发现基因的变异在神经发育生长异常中有重要作用。近年来分子遗传学技术快速发展，关于精神分裂症和不同基因的研究屡屡出现，如DISC1基因、ERBB4基因等［14～16］。因此寻找和精神分裂症发病有密切联系的基因位点非常重要。

目前研究表明PAX基因家族在生物胚胎发育中扮演重要角色，PAX基因家族有PAX1到PAX9共9个不同的成员。PAX6基因由于序列和功能的高度保守性，是目前该基因家族中被研究最为广泛的基因。PAX6位于人染色体第11号染色体长臂13位点（11P13），小鼠2号染色体，基因全长22 kb，mRNA全长2.7 kb，cDNA全长1 269 bp［17］。PAX6基因在大脑发育中起着不可替代的作用［18］，若在大脑皮层发育期出现PAX6的缺陷，极可能会造成皮层、皮层间和皮层内连接严重缺损［7］，有动物研究证实鼠的穹窿海马伞连接区PAX6被敲除会引起该区严重无序，出现海马依赖的记忆缺陷的功能缺失［19，20］，这也可能是人和鼠出生后产生认知缺损的基础。相关研究表明海马神经发生和精神分裂症有密切的关系［21］。还有文献指出PAX6参与调节边缘脑区络丝蛋白（Rein）的神经发生，在对精神分裂症患者的尸检中可以发现，Rein在端脑特定区域表达大幅下降，Rein对大脑突触可塑性、学习记忆起着重要作用，在青春期及成年早期，若突触连接减少或者突触被过度修剪，可以产生精神分裂症的症状，因此推测Rein表达下降与精神分裂症的认知功能下降和其他临床症状有紧密联系［19，22］。此研究提示PAX6基因多态性变化可能会引起脑结构的改变，进而参与精神分裂症的发生。

此次研究中两组SNPs rs667773、rs3026354位点基因分布都符合H-W平衡定律，对比两组的SNPs rs667773位点，其基因型及等位基因分布频率比较差异无统计学意义，但SNPs rs3026354位点的分布频率比较差异有统计学意义，该研究结果表明在中国北方的汉族人群中，精神分裂症的发生发展可能和PAX6基因rs3026354位点多态性的变化有联系。再次对比rs667773、rs3026354位点各个基因型PANSS量表评分结果，发现患者组SNPs rs667773位点的一般精神病理因子分、阳性症状分和阴性症状分比较差异均无统计学意义，患者组rs3026354位点的一般精神病理因子分和阳性症状分比较差异无统计学意义，但阴性症状分比较差异有统计学意义，主要是TT型高于CC型和CT型，这可能是PAX6基因rs3026354位点多态性造成精神分裂症阴性症状易感的原因之一；也可以表明SNPs rs3026354基因型及基因频率的分布可能和精神分裂症之间存在一定联系。然而现在国内外对此方面的研究及文献汇报均较少，故需要进一步研究确认。

此次研究过程中还有一些局限性，未来还需在不同地区不同种族中加大样本量进行重复研究对比，也可从PAX6基因其他的基因表达和功能性位点方面进行研究探索，以便验证此结果。随着精神分裂症与PAX6基因位点多态性之间关系的逐渐阐明，相信PAX6基因位点多态性的改变可作为评估精神分裂症患者症状改善程度一项新的参考指标，为精神分裂症的诊疗及预后评估指明一个新的方向。