蛋白质精氨酸甲基化转移酶5在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义

朱 凯，战 昊，代 智，周 俭

复旦大学附属中山医院肝脏外科，复旦大学肝癌研究所，教育部癌变与侵袭原理重点实验室，上海 200032

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC, 以下简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一。全世界每年约有60万人死于肝癌，其侵袭、转移及复发是患者死亡的主要原因[1-4]。因此，探索肝癌侵袭、转移及复发的分子机制，寻求有效的预防措施，对改善肝癌患者的预后及延长患者的生存时间具有重要意义。

本课题组的前期研究[5]提示，异黏蛋白(metadherin，MTDH)能通过促进上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)增强肝癌细胞的转移能力，高MTDH表达是肝癌患者的不良预后因素，且MTDH是较好的独立预后指标。通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)结合质谱发现，MTDH能与蛋白质精氨酸甲基化转移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)形成蛋白复合体。

PRMT5能将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移至组蛋白上的精氨酸，从而参与多种细胞活动[6-9]。越来越多的研究[10-13]显示，PRMT5与多种肿瘤的发生发展关系紧密。本研究进一步探讨PRMT5在肝癌组织中的表达及其对患者预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2003年1月至2004年3月在复旦大学附属中山医院肝脏外科就诊的323例接受肿瘤切除手术的肝癌患者的肿瘤及正常肝脏组织的组织芯片。患者术前均无远处转移，肝功能分级均为Child-Pugh A级，其中278例(86.1%)感染了乙肝病毒(表1)。323例患者术后中位随访时间为66(2.3～74.0)个月。

1.2 免疫组化染色 肿瘤及正常肝脏组织切片经脱蜡、水化、封闭、浸洗等处理后，加入一抗孵育过夜，加入二抗和DAB显色液，苏木精复染，梯度乙醇脱水后封片，拍照观察。

MTDH抗体(ab45338)由Abcam公司提供。结果判定[14]：染色强度以中位光密度(median integrated optical density, mIOD)为分界点分为高表达组和低表达组： 高表达组IOD>mIOD，低表达组IOD≤mIOD。

PRMT5抗体(#2252)由CST公司提供。对组织中核内和核外的染色强度分别评分[15]：采用SPSS软件计算出IOD的四分位值，将其染色强度由低到高分为-、+、、，并计算各种染色强度所占比例；核内或核外表达评分由“强度×比例”计算得来。如果核内表达评分较高，则判定为核内表达占优势；反之亦然。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0进行统计学分析。MTDH和PRMT5表达情况与其他临床病理特征之间关系采用Pearson卡方检验；采用Kaplan-Meier法分析患者的生存情况，并对其进行log-rank检验。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 PRMT5表达与肝癌患者临床病理指标及MTDH表达之间的关系 PRMT5高表达者占53.3% (172/323)。Pearson卡方检验(表1)提示：PRMT5过表达与年龄、性别、肝硬化、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤大小、肿瘤分化程度、TNM分期及MTDH表达相关(P<0.05)。

表1 肝癌组织PRMT5表达与患者临床病理指标的相关性 n

续表1 n

PRMT5在细胞核内外均有分布，其中PRMT5核内表达占优势者(PRMT5核内组)为36.8% (119/323)。卡方检验(表1)提示：PRMT5核表达模式与年龄、AFP水平、微血管侵犯、肿瘤分化程度及MTDH表达密切相关(P<0.05)。

免疫组化染色(图1)显示：PRMT5在细胞内分布与MTDH存在对应关系。在正常肝脏组织中，MTDH及PRMT5表达均较低；在肝癌组织中，MTDH及PRMT5表达均升高，且有向核外分布的趋势。

2.2 PRMT5表达对患者预后的评估价值

2.2.1 PRMT5表达量及分布对预后的影响 结果(图2A～2D)表明：PRMT5高表达组和PRMT5低表达组患者术后1、3、5年总生存率(84.3%vs87.5%，58.6%vs66.2%, 49.9%vs53.6%)及复发率(25.2%vs25.3%, 49.6%vs50.8%, 59.3%vs58.6%)差异均无统计学意义。PRMT5核内组患者术后3、5年总生存率(70.2%vs58.6%, 61.3%vs46.4%)明显高于PRMT5核外组，复发率则明显低于PRMT5核外组(23.3%vs27.4%, 43.3%vs54.2%, 50.5%vs64.6%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2.2 MTDH表达量联合PRMT5分布对预后的影响 结果(图2E～2H)表明：MTDH高表达PRMT5核外组患者术后1、3、5年总生存率明显低于MTDH低表达PRMT5核内组(74.0%vs93.7%，39.0%vs80.5%，29.4%vs71.9%)，复发率则明显高于MTDH低表达PRMT5核内组(43.3%vs13.0%，67.3%vs36.1%，77.2%vs42.9%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 HCC及癌旁组织MTDH、PRMT5蛋白的表达

A：在正常肝脏组织中，MTDH与PRMT5表达均较低；B：肝癌标本1，MTDH表达量中等、PRMT5表达量高，PRMT5主要分布于细胞核；C：肝癌标本2，MTDH、PRMT5表达量高，PRMT5主要分布于核外.Original magnification: ×40(原图)，×200(放大)

图2 Kaplan-Meier生存曲线分析PRMT5和(或)MTDH表达对肝癌预后的预测价值

PRMT5表达对患者的总生存率(A)及复发率(B)无显著影响；PRMT5核内表达占优势的患者总生存率(C)更高，复发率(D)更低；MTDH表达升高的患者总生存率(E)更低，复发率(F)更高；MTDH高表达PRMT5核外组患者生存率明显低于MTDH低表达PRMT5核内组(G)，复发率明显高于MTDH低表达PRMT5核内组(H)

2.3 患者预后的影响因素分析 单因素和多因素分析结果(表2、表3)表明：PRMT5分布(P<0.05)与MTDH表达(P<0.01)是影响肝癌患者术后生存率与复发的独立预测因素，且两者联合应用的预测价值更大(P<0.001)。

表2 患者术后总生存期和疾病复发的单因素回归分析

表3 患者术后总生存期和疾病复发的多因素回归分析(Cox模型)

*将单因素分析中有统计学意义的因素纳入多因素分析

3 讨 论

PRMT5对细胞功能具有重要的调节作用，其在多种恶性肿瘤中异常表达[7-9]。Powers等[7]发现，乳腺癌组织中PRMT5高表达提示预后不良。Chen等[16]证明，PRMT5通过TGFβ-PRMT5-MEP50通路调节乳腺癌和肺癌细胞的EMT。近期研究[9, 17]显示，PRMT5在白血病及淋巴瘤中发挥重要作用。

本研究中，53.3%患者的肝癌组织表达PRMT5高于对应的正常肝脏组织，但表达高、低组患者预后差异无统计学意义；PRMT5表达核内组患者生存率与复发率高于PRMT5表达核外组(P<0.05)。本研究中，MTDH表达低，PRMT5主要分布于细胞核；随着MTDH表达升高，PRMT5表达明显升高，且有向核外分布的趋势；MTDH表达和PRMT5分布均是肝癌的独立预后因素，且两者联合应用的的预测价值更高(P<0.001)。

PRMT的主要功能为通过甲基化组蛋白H3、H4的精氨酸，改变染色体结构，参与基因转录、DNA修复和RNA合成等[9, 18-19]。其在恶性肿瘤中发挥作用的机制还未完全清楚。近期有研究[20]显示，PRMT5能与Ajuba以及Snail形成蛋白复合体，从而抑制EMT关键分子E-cadherin的表达。本课题组前期研究[21]也提示，MTDH高表达能促进β-catenin由胞质向胞核内转移。PRMT5可能通过上述机制促进肝癌细胞EMT，进而在MTDH介导的肝癌EMT中发挥作用。后续研究中我们将进一步探讨MTDH、PRMT5与E-cadherin以及β-catenin之间的关系。

综上所述，本研究显示PRMT5在肝癌细胞中的分布与肝癌的侵袭和预后密切相关，PRMT5在肝癌细胞中的分布和(或)MTDH表达水平可作为肝癌预后的潜在预测指标。