结直肠腺癌BRAF基因突变的检测及其临床意义

徐 磊，刘 佳，徐一凡，沈立承，江峥增，王 鑫，宿杰·阿克苏，徐 晨，侯英勇，黄 洁

复旦大学附属中山医院病理科，上海 200032

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，最常见的病理类型为腺癌。以手术切除、化学药物治疗和放射治疗为主的综合治疗能有效提高结直肠癌患者的5年生存率[1-3]。近年来，结直肠癌的分子靶向治疗迅速发展，分子靶向药物的联合应用明显延长了晚期结直肠癌患者的生存时间[4-6]。目前应用于结直肠癌的分子靶向药主要为以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)为靶点的单克隆抗体，如西妥昔单抗和帕尼单抗。研究[4-8]发现，发生鼠类肉瘤滤过性病毒致癌基因同源体B1(BRAF)基因突变的患者均对EGFR单克隆抗体耐药。而BRAF基因是结直肠癌治疗的重要靶点。本研究回顾性分析了近年来本院收治的结直肠癌BRAF基因突变患者的BRAF基因检测及突变情况，并探讨了BRAF基因突变与临床病理的关系，进而探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择复旦大学附属中山医院病理科2008年1月至2013年12月接受BRAF基因检测且检测结果为阳性的结直肠癌患者17例。其中，男性7例，女性10例；年龄28～74岁，中位年龄47岁，平均年龄48岁。所有标本均为石蜡包埋标本，其中手术切除标本15例，活检标本2例；所有标本均经病理证实为结直肠腺癌。肿瘤组织学分级2级4例，3级13例；临床分期为Ⅱ期1例，Ⅲ期5例，Ⅳ期11例。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2 BRAF基因测序及分析 结直肠癌组织石蜡包埋，按5 μm厚切片，贴在干净载玻片上，烤片，苏木精-伊红(H-E)染色，刮除非肿瘤组织和出血坏死较明显的区域，收集肿瘤组织，提取肿瘤组织基因组DNA。

将提取的基因组DNA用PCR扩增法扩增BRAF基因11、15外显子。11外显子引物序列为：5′-TTT TCT GTT TGG CTT GAC TTG A-3′(F)，5′- TGT CAC AAT GTC ACC ACA TTA CA-3′(R)；扩增片段为192 bp。15外显子引物序列为：5′- TGC TTG CTC TGA TAG GAA AAT G-3′(F)，5′- AGC ATC TCA GGG CCA AAA AT-3′(R)；扩增片段为228 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应体系为50 μL：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上游引物2 μL(50 pmol)，下游引物2 μL(50 pmol)，模板3～5 μL(1 mg/L)，去离子水补足50 μL。反应条件：94℃ 45 s，62℃ 45 s，72℃ 1 min，36个循环；72℃延伸10 min。

取5 μL PCR反应产物用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，PCR产物经纯化(纯化试剂盒，Axygen)及测序反应( BigDye v3.0试剂盒，ABI)后，用3730XL型测序仪(ABI)测序。所有标本均经正向及反向测序。用Chromas软件分析测序图谱，与基因库BRAF基因序列对比。

1.3 统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行数据分析。计数资料以n(%)表示，计量资料组间比较采用χ2检验。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 BRAF基因突变 结果(图1、表1)显示：17例BRAF基因突变结直肠癌病例中，16例为15外显子突变，1例为11外显子突变。突变主要位于15外显子第600位密码子，共14例(82.4%，14/17)，占15外显子突变的87.5%，包括第1 799位碱基T突变为A(Val600Glu，V600E)13例(92.9%，13/15)，第1 799、1 800位碱基T、G突变为A、A(Val600Glu，V600E)1例。2例突变位于15外显子第594位密码子(11.8%，2/17)，第1 780位碱基G突变为A(Asp594Asn，D594N)。1例11外显子突变位于第468位密码子(5.9%，1/17)，第1 403位碱基G突变为C(Gly468Val，G468V)。

图1 BRAF基因15外显子突变

A：第1 799位碱基T突变为A；B: 第1 780位碱基G突变为A

表1 患者临床病理特征及BRAF基因突变类型

2.2 BRAF基因突变与临床病理指标的相关性 结果(表2)显示：BRAF基因突变与患者性别、年龄无相关性。组织学分级为3级的BRAF基因突变患者数多于2级，差异有统计学意义(P=0.029)；临床分期为Ⅳ期的BRAF基因突变患者数多于Ⅱ期、Ⅲ期，差异有统计学意义(P=0.011)。

表2 BRAF基因突变与患者临床病理特征的相关性 N=17

3 讨 论

BRAF基因位于人类染色体7q34，长度约为190 kb，其编码区可编码相对分子量为67 000～99 000的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该酶是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中重要的转导因子，通过与细胞表面受体结合，将信号传递至细胞核内后，激活细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、禽类髓细胞病毒MC-29的V-myc细胞同源序列(c-myc)等因子，参与调控细胞内的多种生物学事件；而当Ras/Raf/MEK/ERK通路被异常激活时，可导致肿瘤的发生[9-11]。

研究[9,12-13]表明，BRAF基因与K-RAS基因虽然同参与Ras/Raf/MAPK通路，但两者突变具有相互排他性，BRAF基因能不依赖于K-RAS基因而独立参与肿瘤的发生发展过程。研究[14]显示，黑素瘤和结肠癌患者中BRAF基因突变率分别为66%、15%。该研究显示，主要有2种突变类型，约89%的突变位于15位外显子，其中约92%发生于第1 799 位碱基( T突变为A)，导致其所在的第600位密码子编码的谷氨酸被缬氨酸取代(V600E)；约10%的突变位于11位外显子，发生如G463、G465、G468等位点突变。本研究17例BRAF基因突变的结直肠癌患者中，BRAF基因突变主要位于15外显子第600位密码子(V600E，82.4%)，其中第1 799 位碱基突变(T突变为A)占92.9%；此外，还有2例15外显子第594位密码子突变(D594N)和1例11外显子第468密码子突变(G468V)，与文献[14]报道相符。

本研究未发现结直肠癌中BRAF基因突变与患者性别、年龄的相关性，与其他研究结论[15-16]一致。本研究中，随着组织学分级的增加，BRAF基因突变患者人数增加，且差异有统计学意义(P<0.05)，与Yuen等[16]的研究结论相符。结果提示BRAF基因可作为结直肠癌诊断、治疗的指标。本研究还发现，临床分期中Ⅳ期BRAF基因突变患者人数比Ⅱ期、Ⅲ期多(P<0.05)，可能与BRAF基因突变激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，导致下游信号通路MEK/ERK激活有关。动物实验[17]表明，采用特异性MEK激酶抑制剂阻断该通路，可抑制黑素瘤的肺转移，甚至能使已经产生的肺转移灶缩小、消失。ERK活性增加除影响多种恶性肿瘤相关基因表达外，还影响肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的活性，降低E-钙黏素表达和增加基质金属蛋白酶( MMP) 分泌[18]，导致肿瘤细胞增殖和侵袭能力升高。

越来越多的研究[19-22]发现，BRAF突变预示转移性结直肠癌(mCRC)的患者预后较差。Samowitz等[22]认为，BRAF基因V600E突变是结肠癌患者总生存时间(OS) 强有力的预后因子，在微卫星不稳定性(MSI)低或稳定的肿瘤患者中更是如此。研究[22]也表明，BRAF基因V600E突变提示结肠癌患者预后不良，而且其预测作用与临床分期和治疗方式无关。该研究对100余例接受手术治疗的Ⅱ期结肠癌患者和200余例接受5-氟尿嘧啶辅助化学治疗的Ⅲ期结肠癌患者进行的生存分析结果表明，BRAF基因V600E突变是结肠癌患者总生存时间和癌症特异性生存时间的独立预测因素。因此，BRAF基因可能为结肠癌的不良预后预测因子。

近年来，使用靶向药物治疗结直肠癌已改善了患者的预后和生存质量。然而，Roock等[23]的研究表明，西妥昔单抗联合化疗对BRAF突变患者的有效率明显低于野生型者(8.3%vs38.0%，P=0.001 2)；而PRIME研究显示，BRAF基因突变患者不能从帕尼单抗治疗中获益[24]。因此，在对结直肠癌患者进行EGFR单克隆抗体治疗前，应进行BRAF基因检测。

目前，以BRAF信号通路上的关键分子为靶点的抑制剂在黑素瘤患者中取得了良好的疗效。2011年，首个针对BRAF基因V600E突变的抑制剂威罗菲尼(vemurafenib, PLX4032)获美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，用于治疗BRAF基因V600E突变的黑素瘤患者。2015年，小分子MEK抑制剂考比替尼(cobimetinib)获FDA批准，该药可联合威罗菲尼用于BRAF V600E或V600K突变阳性、不可切除性或转移性黑素瘤患者的治疗。与威罗菲尼+安慰剂组相比，考比替尼与威罗菲尼联合治疗组疾病恶化或死亡风险显著降低，中位无进展生存期(9.9个月vs6.2个月，P<0.001)显著延长[25]。然而，在结直肠癌领域，目前有关BRAF基因的研究还没有临床获益[26]，说明肿瘤信号转导通路还有待深入研究。

综上所述，BRAF基因突变与结直肠腺癌患者临床病理特征相关，可能是一项潜在的预后指标。结直肠癌患者BRAF基因突变情况及EGFR靶向治疗仍须进一步的研究，以进一步阐述结直肠癌发生发展的分子机制，并为寻找新的治疗靶点和药物提供理论依据。