解毒通络调肝方对2型糖尿病大鼠肝组织中肌醇依赖酶1/c-Jun氨基末端激酶通路相关蛋白表达的影响

朴春丽 刘向荣 金美英 唐 程 王 丽

(广州中医药大学深圳医院(福田)，广东 深圳 518034)

内质网应激(ERS)是2型糖尿病(T2DM)发病的重要环节，对于ERS的研究开始于2002年，Harding等〔1〕提出了T2DM通过ERS而发病。肌醇依赖酶(IRE)1/JNK信号通路是ERS参与胰岛素抵抗(IR)和胰岛β细胞凋亡的主要信号通路〔2〕。本课题组前期实验证实解毒通络调肝方具有多靶点、多通路改善IR和保护胰岛β细胞功能的作用，本文对其相关机制进行进一步探讨〔3,4〕。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与饲养 ZDF大鼠88只，ZL大鼠10只，均为雄性9周龄、SPF级(北京维通利华实验动物技术有限公司)，许可证编号：(SCXK京 2012-0001)。实验大鼠饲养于洁净动物房，置于洁净动物橱中(北京文慧净化设备厂制造，专利号：EJ932041477)，环境温度控制在23～25℃，相对湿度50%～60%，当天禁食不禁水，所有大鼠自由饮水。

1.1.2药物 解毒通络调肝方(榛花15 g、大黄30 g、黄连15 g、双花15 g、黄芪30 g、丹参15 g、柴胡10 g，长春中医药大学附属医院制剂室提供，4℃保存)；对照药物为盐酸二甲双胍片(天津太平洋制药有限公司，国药准字：批号 080313)。

1.1.3试剂 一抗：IRE1-抗-IRE1抗体，批号：ab37073/GR82255-15；p-IRE1-抗-IRE1(phospho S724)抗体，批号：ab48187/GR229154-2；JNK-抗- JNK1+JNK2+JNK3抗体，批号：ab179461/GR209447-4；P-JNK-抗-JNK1+JNK2 (phospho T183+Y185)抗体，批号：ab4821/GR87526-29；厂家：Abcam。二抗：山羊抗兔IgG(HRP)，批号：ab6721/GR231489-7。厂家：Abcam。磷酸二氢钠，西陇化工厂，批号：0908011；磷酸氢二钠，批号00100708；柠檬酸，批号：20130109；甲醇，批号：20140706；30%过氧化氢，批号：20140416；厂家：北京仪工厂。山羊血清，中杉金桥，批号：WK153325；Triton，批号：95500140，厂家：Sigma。

1.1.4实验仪器 电热恒温培养箱，华连理化器材厂；罗氏血糖仪及配套血糖试纸；普通光学显微镜，Olympus L340099；低温高速离心机，GermanyMlKR002R；轮转式组织切片机；桌式振荡器；日本日立7160全自动生化仪；精密电子天平(MettleAE160)；TOAHM-20E pHMrter，日本。

1.2实验方法

1.2．1动物模型的建立 88只9周龄雄性ZDF大鼠以Purina #5008饲养,10只9周龄雄性ZL鼠以#1022普通饲料维持饲养。饲养过程中动态观察大鼠随机血糖的变化，随机血糖≥11.1 mmol/L视为T2DM成模。第10周对ZDF大鼠随机血糖监测结果：<11.1 mmol/L 34只；11.1～16.9 mmol/L 18只；>16.9 mmol/L 36只。根据上述3种血糖梯度，大鼠重新分笼，>16.9 mmol/L的大鼠移至通风较好的环境喂养，排除环境因素对血糖的影响。将未符合成模标准的大鼠重新随机分组饲养，并随机测量血糖，已成模的大鼠测血糖，判断其模型的稳定性及持续性。按照上述方法至第13周成功制备T2DM大鼠模型59只，将已成模的ZDF大鼠随机分组。

1.2．2实验分组 10只ZL大鼠作为空白对照组；成模ZDF大鼠随机分为模型组(15只)，西药组(11只)，解毒通络调肝方大剂量组(11只)、中剂量组(11只)、小剂量组(11只)。

1.2．3给药 第17周开始给药，西药组：临用前将二甲双胍搅拌至完全溶解，用蒸馏水稀释，给药剂量为0.75 g/60 000×7倍。解毒通络调肝方大、中、小剂量组：蒸馏水稀释，灌胃剂量为5、3、1 g·kg-1·d-1(按所含原药材量计算)。模型组与空白对照组以等体积蒸馏水灌胃，1次/d，灌胃时间均为每日上午9∶00，持续4 w。

1.2．4观察指标及检测方法

1.2.4.1观察指标 IRE1、P-IRE1、JNK，P-JNK表达水平。

1.2.4.2检测方法 一抗稀释浓度：IRE1 1∶325，P-IRE1 1∶90，JNK 1∶75，P-JNK 1∶1 000；二抗稀释浓度：1∶1 000。实验步骤：肝组织从-4℃复温 30 min；常规脱蜡;Triton 37℃ 10 min,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)3 min×3；H2O2-CH3OH，10 min避光,0.01 mol/L PBS 3 min×3；微波修复，自然冷却1 h，0.01 mol/L PBS 3 min×3；加蛋清20 min 0.01 mol/L PBS 3 min×3；加山羊血清30 min 37℃，甩去；滴加一抗4℃过夜；从4℃复温1 h，0.01 mol/L PBS 3 min×3；滴加二抗37℃ 30 min。0.01 mol/L PBS 3 min×3；二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下观察；自来水洗，ddH2O水洗；苏木素复染、自来水冲洗；常规脱水；中性树胶封片，镜下观察结果。

2 结 果

2.1各组大鼠肝脏IRE1、P-IREI蛋白表达水平 空白对照组肝细胞胞质中无棕黄色颗粒状反应物。模型组肝细胞质中有棕黄色颗粒状反应物，说明有IRE1、P-IREI蛋白表达。与空白对照组比较，模型组、西药组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组肝细胞质中IRE1、P-IREI蛋白表达均增多(P<0.05)；与模型组比较，西药组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组肝细胞质中IRE1、P-IREI蛋白表达明显减少(P<0.01)；给药后，与解毒通络调肝方中剂量组比较，解毒通络调肝方大、小剂量组肝细胞质中IRE1、P-IREI蛋白表达增加(P<0.05)。见表1，图1。

2.2各组肝脏JNK、P-JNK蛋白表达的比较 空白对照组肝细胞质无棕黄色颗粒状反应物。模型组肝细胞质有棕黄色颗粒状反应物，JNK、P-JNK蛋白强阳性表达。与正常对照组比较，模型组、西药组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组肝细胞质中JNK、P-JNK蛋白表达增多(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，西药组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组肝细胞质中JNK、P-JNK蛋白表达减少(P<0.05，P<0.01)；与解毒通络调肝方中剂量组比较，大、小剂量组肝细胞质中JNK、P-JNK蛋白表达增加(P<0.05)。见表1，图2，图3。

表1 各组大鼠肝组织IRE1、P-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达比较

与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.01，4)P<0.05；与中药复方中剂量组比较：5)P<0.05

图1 免疫组化方法检测肝组织p-IRE1蛋白表达(×400)

图2 免疫组化检测肝组织JNK蛋白表达(×400)

图3 免疫组化检测肝组织p-JNK蛋白表达(×400)

3 讨 论

T2DM归属于中医消渴病的范畴，因嗜食肥甘、厚味，劳逸失常等导致脾胃的功能受损，脾气虚弱水谷精微化生不足，清气不升，浊气不降，气机壅滞而化生为瘀血痰浊，日久淤而化热，痰、湿、浊、瘀、热邪相互胶着致病，是 T2DM、IR 毒邪形成的物质基础。本研究导师从“毒损肝络”论治T2DM、IR，根据“毒邪”理论与“络病”理论的基本病机，创立解毒通络调肝法为治疗 T2DM、IR 的大法〔5〕。基于此创立解毒通络调肝方，以榛花、大黄解毒，排毒为君药；黄连、双花清热解毒，燥湿祛浊；黄芪、丹参益气通络，扶正祛邪，共同增强君药的作用，为臣药；柴胡引诸药入肝经，调畅气机，为佐使药。全方攻补兼施、扶正祛邪。对于 T2DM患者临床治疗效果显著，大量实验也证明解毒通络调肝方可通过抗炎症因子的作用对T2DM发挥治疗作用〔6〕。

IR是T2DM主要危险因素。疾病的前期，机体通过提高β细胞的数量和胰岛素的分泌量改善IR，当β细胞的数量和胰岛素的分泌量不能满足机体需要时，这种稳态被打破，胰岛素的相对不足就会随之出现，T2DM随之发生〔7〕。文献报道，IR发生的依赖机体内质网应激的启动，IRE1、RNA依赖的蛋白激酶样激酶(PERK)、活化转录因子(ATF)6是内质网上3种跨膜蛋白感受器，用于感受未折叠或错误折叠蛋白质信号，并将此信号传递到细胞基质〔8〕。ERS激活的 IRE1α/JNK 信号通路可以导致胰岛素受体及其底物功能障碍，是发生IR和β细胞凋亡的重要原因〔9，10〕。JNK信号通路是当未折叠或者是错误折叠蛋白过度累积时，IR发生，IRE-1α与Bip/Grp78分离，在Ser724点位上发生磷酸化及寡聚化反应，形成P-IRE1α，Yamaguchi〔11〕证明凋亡信号调节激酶ASK1自身可以通过ASK-p38路径诱导细胞凋亡，形成IRE-TRAF2-ASK1复合体，激活JNK，激活线粒体依赖的细胞凋亡 。JNK被激活后可促进胰岛素受体底物丝氨酸的磷酸化，阻碍胰岛素的信号转导，最终促使炎症细胞表达，引起ERS，导致IR〔12〕。

本实验中ZDF鼠存在高糖、高脂、肥胖应激状态，并且给药前肝细胞质中均有IRE1及P-IRE1、JNK及P-JNK 蛋白表达，证实了通过给予Purina #5008高脂饲料，ZDF鼠可诱导形成糖尿病模型；同时，解毒调肝通络方及二甲双胍均能通过减少IRE1、P-IREI、JNK及P-JNK 蛋白的表达，抑制IREl-JNK信号通路，起到改善IR、减少细胞凋亡的作用；而且解毒通络调肝方中剂量组有较好的改善IR、减少凋亡的作用，但是鉴于本实验局限于免疫组化定性研究，需进一步定量研究以证实。