西南地区汉族人群慢性胰腺炎糜蛋白酶C基因突变分析

汪洋，严茂林，陈和平

(1电子科技大学附属医院 四川省人民医院，成都610072；2电子科技大学医学院)

慢性胰腺炎(CP)是胰腺长期进行性不可逆性炎性疾病，持续性胰腺炎症会导致罹患胰腺癌的风险增加。CP的病因复杂，基因与环境相互作用在CP发生发展中发挥重要作用。近年来，与CP相关的易感基因和保护基因变异位点不断被发现，糜蛋白酶C(CTRC)基因已被证实为CP易感基因，该基因部分突变可以使酶分泌减少并降低其酶活性[1，2]，从而增加CP的发生风险。CTRC基因编码区和非编码区有大量新的单核苷酸多态性(SNP)位点，这些SNP位点与CP发病有关。本研究旨在通过基因测序筛选西南地区汉族人群CTRC基因有意义的基因变异，从基因层面上探讨CP的发病机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年10月～2018年2月在四川省人民医院和崇州市人民医院住院治疗的汉族CP患者108例(CP组)，男62例、女46例，年龄(57.0±15.4)岁，吸烟35例、饮酒24例。均符合中华医学会《慢性胰腺炎诊治指南》[3]中的诊断标准。排除合并其他胰腺疾病(如胰腺癌、胰腺囊肿等)；高血压、糖尿病等代谢性疾病；遗传性疾病；自身免疫性疾病患者。另选取同期健康体检的汉族人群150例作为对照组，男88例、女62例，年龄(60.0±16.9)岁，吸烟32例、饮酒28例。两组性别、年龄、吸烟、饮酒情况具有可比性。本研究经四川省人民医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 CTRC基因检测方法

1.2.1 DNA提取 采集受试者外周静脉血4 mL，EDTA抗凝。采用DNA抽提试剂盒提取白细胞核DNA。利用NanoDrop 2000分光光度计检测DNA浓度与纯度，OD值检测在1.6～1.8保证样本达标，校正样本浓度为50 ng/μL，-20 ℃保存。

1.2.2 引物设计及合成 在UCSC数据库检索CTRC基因序列，截取外显子及附近内含子序列，使用Primer3.0在线设计引物，由上海生工公司进行序列合成。稀释保存于-20 ℃。

1.2.3 PCR扩增 PCR扩增体积10 μL。反应采用MyCycler Thermal Cycler扩增仪。反应体系：2×Taq Master Mix 5 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，DNA 1 μL，双蒸水3 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55～65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃ 7 min，12 ℃保温。取扩增产物，采用2%琼脂糖电泳，电压120 V、时间20 min，获取清晰特异的条带，取对应的PCR产物进行测序。

1.2.4 PCR产物纯化及测序 使用纯化酶将PCR产物纯化后，用上述扩增仪进行纯化程序和测序程序。纯化体积10 μL。纯化反应体系：纯化酶2 μL，PCR产物6 μL。纯化条件：80 ℃15 min，37 ℃ 30 min，12 ℃保温。测序体积10 μL。测序反应体系：BigDye 0.3 μL，5×Buffer 2 μL，引物(正向或反向)0.33 μL，纯化后的DNA 2 μL，双蒸水5.37 μL。测序条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55～65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共29个循环；72 ℃ 7 min，12 ℃保温。反应后产物进行乙醇纯化离心，避光晾干30 min，加入10 μL双蒸水，使用ABI3130基因分析仪进行测序，Chromas Lite Application软件分析实验结果，判定外显子序列碱基是否有变化。

1.2.5 序列比对及预测分析 测序峰图中不同颜色代表不同碱基，绿色表示脱氧腺嘌呤核苷酸，黑色表示脱氧鸟嘌呤核苷酸，红色表示脱氧胸腺嘧啶核苷酸，蓝色表示脱氧胞嘧啶核苷酸。单峰表示基因型为纯合，双峰表示基因型出现杂合。使用DNAMAN软件将测序结果与数据库获得的目的基因相应序列进行比对，确定判读结果的可靠性。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。使用Fisher确切概率检验频率变化。使用优势比(OR)和相应95%置信区间(95%CI)表示遗传模型和环境与CP的相关性。显性模型为AB+AAvs.BB(A为最小等位基因，B为主要基因)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组CTRC基因变异检测结果 CP组CTRC基因第6外显子检测到1例c.611G>A杂合错义突变，导致第204位甘氨酸改变为谷氨酸，预测突变性质为可能致病；第7外显子检测到1例c.703G>T杂合错义突变，导致第703位缬氨酸改变为苯丙氨酸，预测突变性质为可能致病；第7外显子检测到1例c.736C>T杂合错义突变，导致第736位精氨酸改变为半胱氨酸，预测突变性质为良性。对照组外显子区域未检出CTRC基因突变。另外发现5个SNP位点，均为于内含子区域，分别为第1内含子的c.40+92T>A、c.40+133G>A，第5内含子的c.493+49G>C、c.493+51C>A，第7内含子的c.793-137A>G；CP组c.40+133G>A、c.493+49G>C位点发生频率高于对照组(P<0.05或<0.01)。见表1。

表1 两组CTRC基因内含子区域SNP位点发生情况比较[例(%)]

2.2 两组CTRC基因SNP位点基因型频率与等位基因频率比较 经上述统计分析筛选有意义的SNP位点，进一步行基因型频率和等位基因频率比较。CP组与对照组c.40+133G>A位点基因型频率和等位基因频率比较、c.493+49G>C位点基因型频率和等位基因频率比较，差异均有统计学意义(P<0.05或<0.01)。见表2、3。

表2 两组CTRC基因SNP位点基因型频率比较[例(%)]

表3 两组CTRC基因SNP位点等位基因频率比较[例(%)]

2.3 CTRC基因SNP遗传模型与CP的关系 在显性模型中,c.40+133G>A位点在两组间的分布比较，CP组患病风险是对照组的1.088倍(P=0.030，95%CI为1.002～1.181)；c.493+49G>C位点在两组间的分布比较，CP组患病风险是对照组的1.150倍(P=0.004，95%CI为1.038～1.275)。

2.4 CTRC基因SNP位点与吸烟、饮酒的关系 两组饮酒者比较，c.40+133G>A位点和c.493+49G>C位点的分布差异均无统计学意义(P均>0.05)；两组吸烟者比较，c.493+49G>C位点分布差异有统计学意义(OR=4.667，95%CI=1.341～16.239，P=0.014)。见表4、5。

表4 两组吸烟者的CTRC基因SNP位点分布比较(例)

表5 两组饮酒者的CTRC基因SNP位点分布比较(例)

3 讨论

CP是一种由遗传和环境因素共同作用所致的进展性疾病，病因复杂。研究发现，CTRC基因的功能丧失性突变会增加CP患病风险[4～7]。Grabarczyk等[8]发现，SNP位点与CP有很强的相关性。CTRC基因位于染色体1p36.21上，长度8.2 kb，包含8个外显子。该基因编码CTRC蛋白，非活化状态的CTRC蛋白由16个氨基酸的分泌信号肽、13个氨基酸的前肽(活化肽)和239个氨基酸的糜蛋白酶样酶组成，活化后可以促进胰蛋白酶原的自动激活，降解胰蛋白酶和胰蛋白酶原，并辅助活化CPA1和CPA2[9]。与CP相关的CTRC基因突变目前共发现54个，包括26个错义突变、5个移码突变、4个同义突变、一个框内微突变及18个非编码区的突变[10]，如主要发生在印度人的p.A73T和p.V235I突变以及主要发生在欧洲人种的p.R254W和p.K247_R254del突变[11，12]等。突变谱的不一致表明疾病的遗传学病因与地域、人种等有关。此外CTRC基因的SNP改变也是CP发生的一个重要关联因素。目前共发现3 209个CTRC基因SNP改变，包括rs121909294等致病性改变。Masson等[13]研究发现，两个常见的同义CTRC基因多态性c.285C>T和c.180C>T，且c.180C>T多态性位点与CP发生有相关性。目前CP中研究最多的SNP位点是c.180C>T。

本研究利用Sanger直接测序法，对CTRC基因进行位点变异分析。结果显示，CP组第6外显子检出1例c.611G>A杂合错义突变，外显子7上分别检出1例c.703G>T杂合错义突变和1例c.736C>T杂合错义突变，对照组未检出上述突变。检索国内外文献，c.611G>A和c.703G>T杂合错义突变未见报道。软件预测突变c.611G>A和c.703G>T为致病性突变，c.736C>T突变为非致病性突变。生物信息学领域的预测尚需基础的功能验证上述突变是否为致病性突变以及其具体的致病机制。此外还检测到5个位于内含子的SNP位点改变：c.40+133G>A、c.40+92T>A、c.493+49G>C、c.493+51C>A和c.793-137A>G。位点c.40+133G>A为新发现的SNP改变，未在NCBI数据库上找到相应的rs号。CTRC基因c.40+133G>A和c.493+49G>C位点具有组间显著差异。c.40+133G>A位点基因型分布和等位基因频率在CP组分布高于对照组，在显性模型下CP患病风险是对照组的1.088倍。c.493+49G>C位点基因型分布和等位基因频率在CP组也显著高于对照组，在显性模型下CP患病的风险是对照组的1.150倍。表明CTRC基因c.40+133G>A和c.493+49G>C位点与中国西南汉族CP患者的发病可能存在一定关系，提示基因与疾病关联的异质性与种族和地区等因素有关。CP与吸烟和饮酒有很强的关联性。LaRusch等[14]研究表明，伴有CTRC基因G60G位点单体型的吸烟者或酗酒者CP患病率更高。因此我们进一步探讨了SNP位点与吸烟和饮酒的关系。在吸烟因素存在的情况下，具有c.493+49G>C位点改变的CP患病风险是对照组的4.667倍。其机制可能是吸烟引起的应激导致胰蛋白酶损伤而致病。多项研究表明c.180C>T位点与CP发病相关，但本研究未通过测序找到该SNP位点改变，其原因可能是样本量小，未能验证到该位点与CP的关系；或该位点基因型存在人群和地域差异。

综上所述，本研究丰富了西南地区CTRC基因位点改变数据，表明不同地域、种族间位点变异分布有差异性。杂合错义突变c.611G>A、c.703G>T和c.736C>T可能与西南地区汉族人群CP发病有关，SNP位点c.40+133G>A和c.493+49G>C可能是西南地区汉族人群CP易感位点，有位点c.493+49G>C改变的吸烟者可能有CP发病倾向。