单纯疱疹病毒性脑炎和脑膜炎患者脑脊液和血清趋化因子水平比较

张晨红，王建峰，陈华，李晓宁

(陕西省核工业215医院，陕西咸阳712000)

单纯疱疹病毒(HSV)可以引起中枢神经系统(CNS)炎症，HSV-1通常引起单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)，HSV-2通常引起单纯疱疹病毒性脑膜炎(HSM)[1]。HSE和HSM均表现为神经系统症状，但HSE较HSM严重，如果治疗不及时，往往会遗留永久后遗症甚至急性期死亡。因此，及时鉴别HSE和HSM对于避免延误治疗和改善患者预后尤为重要。HSE和HSM中均发生CNS炎症应答，主要表现为脑脊液淋巴细胞增多和蛋白含量增加[2]。研究发现，炎症细胞移行到感染部位依赖于趋化因子[3]，趋化因子调控着白细胞的迁移，在炎症反应中发挥重要作用[4]。既往研究显示，不同趋化因子在健康人群[5，6]、HSE[7]、虫媒病毒性脑炎[8]和肺炎球菌脑膜炎[9]脑脊液中的水平不同，提示趋化因子在CNS炎症过程中具有重要作用，但是目前尚缺乏趋化因子在鉴别HSE和HSM方面的相关报道。依据N端半胱氨酸残基位置和数目，趋化因子分为4个亚族：CC亚族(28个成员，CCL1～CCL28)、CXC亚族(17个成员，CXCL1～CXCL17)、C亚族(2个成员，XCL1和XCL2)和CX3C亚族(惟一成员，CX3CL1)。本研究采用Bio-Plex悬液芯片技术，检测HSE和HSM患者脑脊液和血清中30个趋化因子水平，分析HSE和HSM趋化因子水平的差异。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入标准：①年龄≥18岁；②具有CNS感染症状(如发热、头痛、颈强直、意识状态改变、局灶性神经症状或癫痫发作)；③HSE诊断标准采用国际共同声明定义，即精神状况改变(意识改变、昏睡、人格改变)持续时间>24 h，并具有下述表现中的至少3项：发病前72 h或发病后体温≥38 ℃，癫痫发作，新发局灶性神经缺损，脑脊液白细胞计数≥5×103/L，脑电图异常[10]；同时患者入院时通过实时定量TaqMan PCR法检测出HSV-1；④HSM诊断标准：临床表现有脑膜刺激症状(头痛、恶心或呕吐、颈强直、脑膜刺激征阳性)，MR或CT改变排除脑炎，入院时通过实时定量TaqMan PCR法检测出HSV-2 DNA[1]；⑤排除合并其他病毒性脑炎或脑膜炎。选择2013年6月～2016年5月我院收治的符合上述纳入标准的HSE和HSM患者各20例。HSE组男9例、女11例，年龄28～73岁、中位年龄45.0岁； HSM组男4例、女16例，年龄29～61岁、中位年龄41.5岁。另外选择20例存在头痛，但脑脊液常规和生化正常、细菌和病毒阴性的患者作为对照组，排除感染、自身免疫性疾病及神经系统疾病。对照组男10例、女10例，年龄23～66岁、中位年龄43.0岁。三组性别、年龄具有可比性。本研究经我院伦理委员会批准，受试者签署知情同意书。

1.2 趋化因子检测方法 受试者在症状出现后的20 d内采集脑脊液和血清标本，脑脊液标本离心去除细胞，与血清标本储存于-70 ℃待测。采用Bio-Plex悬液芯片技术检测脑脊液和血清中的30个趋化因子，即11个CXC亚族(CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16)，18个CC亚族(CCL1、CCL2、CCL3、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27)和CX3CL1。试剂盒购自Bio-Plex ProTM(Bio-Rad Laboratories)，按照说明书要求操作。通过Bio-Plex200系统测定，采取五参数Logistic标准曲线计算趋化因子水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件。因本研究各组样本数<50，因此计量资料选择Shapiro-Wilk检验分析数据正态性。经统计学分析，本研究全部数据呈非正态分布，计量资料以中位数(M)表示。非正态分布数据的组间比较采用Mann-WhitneyU检验。脑脊液和血清之间配对数据的比较采用Wilcoxon配对符号秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组脑脊液中趋化因子水平比较 见表1。对照组脑脊液中检出CX3CL1和8个CXC亚族趋化因子(CXCL1、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL16)、5个CC亚族趋化因子(CCL1、CCL2、CCL15、CCL21和CCL25)。与对照组比较，HSE组脑脊液中有22个趋化因子水平增加，HSM组脑脊液中有25个趋化因子水平增加(P均<0.05)。与HSE组比较，HSM组脑脊液中CXCL5、CXCL8、CXCL11、CCL8、CCL13水平升高(P均<0.05)。

表1 三组脑脊液中趋化因子水平比较(pg/mL，M)

注：与对照组比较，*P<0.05；与HSE组比较，#P<0.05。

2.2 三组血清中趋化因子水平比较 见表2。对照组血清中检出CX3CL1和全部11个CXC亚族趋化因子、全部18个CC亚族趋化因子。与对照组比较，HSE组血清中有7个趋化因子水平增加(P均<0.05)，HSM组血清中各趋化因子水平与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。全部趋化因子在HSE组和HSM组之间差异无统计学意义。

2.3 HSM和HSE组脑脊液与血清中趋化因子浓度的比较 考虑到可能存在着依赖趋化因子浓度梯度而导致细胞从血液向脑脊液迁移的情况，我们对HSE组和HSM组患者脑脊液和血清中水平升高的趋化因子进一步分析，筛选脑脊液浓度/血清浓度>1的趋化因子。结果显示，CXCL8、CXCL9和CXCL10在HSE和HSM组脑脊液中水平均升高，符合脑脊液浓度/血清浓度>1；CCL8和CXCL11仅在HSM组中脑脊液浓度/血清浓度>1，在HSE组中脑脊液/血清浓度均<1；其余趋化因子在HSM和HSE组中脑脊液/血清浓度均<1。

表2 三组血清中趋化因子水平比较(pg/mL，M]

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

依据病毒血清型，HSV引起的CNS炎症分为HSE、HSM两类。HSE的发生率为2/1 000 000～4/1 000 000，发病无性别差异；HSM的发生率为20/1 000 000～40/1 000 000，男女比例约为1∶6[1，11]。HSV-1主要引起唇部疱疹，经由三叉神经或颞叶嗅神经节扩散到CNS繁殖。多数HSE患者核磁共振成像(MRI)可显示上颞叶炎症损害，临床表现为高热、头痛、癫痫发作、定向力障碍和言语困难等症状。未进行抗病毒治疗的HSE患者病死率超过70%，往往导致严重的神经后遗症。HSV-2通常引起生殖道黏膜感染，经由骶神经节传播到CNS，HSM综合征较HSE综合征轻，临床表现为发热、头痛颈强直、光过敏等。一般来说，HSE的临床经过较HSM严重，如果延误诊断和治疗，更容易发生急性期死亡和严重后遗症。因此，寻找鉴别HSM和HSE的生物学标记，对于减少临床误诊、漏诊，提高诊断准确性并及时治疗具有重要意义。

趋化因子具有趋化细胞的迁移、在免疫监视中控制免疫细胞趋化、刺激炎症细胞因子释放等作用。既往研究显示，单核细胞趋化因子CCL2、CX3CL1、CCL15、CCL20等在健康人CNS中表达[5,6]；我们在非CNS感染对照人群的脑脊液中也发现了部分趋化因子。值得注意的是，本研究发现了几个趋化因子在脑脊液水平超过了血清中的稳态水平，与对照组比较，CXCL8、CXCL9、CXCL10在HSE和HSM患者脑脊液中均增加，而CCL8和CXCL11仅在HSM患者脑脊液中显著增加。

研究发现，细菌性脑膜炎患者脑脊液中CXCL8水平升高，同时伴随着中性粒细胞增加，CXCL8的2个受体CXCR1和CXCR2表达于中性粒细胞表面，通过绑定而诱导中性粒细胞的迁移。Rösler等[7]报道，HSE患者脑脊液中CXCL8水平升高，并且在病程中长期稳定存在。本研究结果显示，HSE和HSM患者脑脊液中CXCL8水平高于血清，但是相比于HSE，在HSM脑脊液中的水平更高。

趋化因子受体CXCR3主要表达在CD4+和CD8+T细胞表面，可以与CXCL9、CXCL10、CXCL11结合，与CXCL11亲和力最高[12]。CXCR3缺陷型小鼠对HSV-2的易感性增加，并且很快死亡[13]；但是在HSV-1感染小鼠，CXCR3缺陷却对致命性CNS起到了保护作用[14]，提示CXCR3的作用或许依赖于小鼠的品系和组织特异性。与本研究结果相似，许多其他CNS炎症脑脊液中CXCL9和CXCL10水平也升高[8]。但是，本研究发现CXCL11仅在HSM而不是HSE患者脑脊液中增多。其机制可能是HSM患者体内单个核细胞分泌大量IFN-γ进入脑脊液，从而诱导CXCL11明显增加。也可能存在其他机制，如CXCL10和CXCL11启动子包含IRSE元件，但是CXCL9启动子则没有IRSE元件；STAT3-STAT1异源二聚体绑定到CXCL11启动子，但是STAT1-STAT2异源二聚体绑定到CXCL9和CXCL10启动子[12]。其具体机制仍需进一步研究。

CCL8参与Th2应答，与淋巴细胞、单核细胞迁移相关，刺激嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞增殖。本研究结果显示，CCL8仅在HSM脑脊液中增加。此外，CCL8也高表达于肺炎球菌脑膜炎[9]，但是在产单核李斯特菌脑膜炎的脑脊液中是阴性的。关于CCL8的研究目前相对较少，其在HSM脑脊液中增高的意义仍有待进一步充实。

总之，本研究显示HSE和HSM脑脊液中趋化因子水平不同。尽管HSE病情较HSM更严重，但是HSM脑脊液中存在更多的趋化因子。CXCL8、CXCL9和CXCL10在HSE和HSM患者脑脊液中增多，但是仅HSM患者脑脊液中CCL8和CXCL11升高。推测CCL8和CXCL11可作为鉴别HSM和HSE的潜在指标。