miR-20b对自身免疫性肝炎小鼠肝脏的保护作用及机制

孟子愉，朱恩东

(天津医科大学代谢病医院内分泌研究所 国家卫生健康委员会激素与发育重点实验室 天津市代谢性疾病重点实验室，天津300070)

自身免疫性肝炎是由自身免疫反应介导的慢性进行性肝脏炎症性疾病，其病因目前尚未明确[1～3]。糖皮质激素单用或与硫唑嘌呤联用是目前治疗自身免疫性肝炎的标准疗法，但患者常出现血细胞减少、骨质疏松、糖尿病等不良反应。随着对该病研究的逐渐深入，寻找新的治疗方式成为研究热点。微小RNA(miRNAs)是由20～25个核苷酸组成的非编码RNAs，通过结合靶基因的3′UTR区引起mRNA降解，从而负向调控其功能。miRNAs可以影响细胞增殖、凋亡、黏附、迁移等生理过程，同时对恶性肿瘤的发生发展及免疫系统的调节发挥重要调控作用[4]。研究表明，miR-20b在T淋巴细胞白血病、乳腺癌及多发性硬化症等疾病进程中均发挥调控作用[5～8]。但目前miR-20b在自身免疫性肝炎中作用的研究相对较少。2017年12月～2018年4月，我们采用刀豆蛋白(ConA)诱导小鼠自身免疫性肝炎，检测血清和肝组织中炎症因子水平，探讨miR-20b对肝脏的保护作用，为自身免疫性肝炎的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 SPF级C57BL/6J品系野生型雄性小鼠52只，8～10周龄，体质量20～25 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。HEK-293T细胞由本实验室保存。Ⅳ型ConA、吐温-20购于美国Sigma公司；ALT检测试剂盒购于上海荣盛生物药业有限公司；IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 ELISA检测试剂盒购于美国Biologend公司；TRIzol、Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司；Prime Script RT Reagent Kit反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购于日本TaKaRa公司；实时荧光定量PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成设计；DMEM/H培养基购于美国Hyclone公司；胎牛血清、Opti-MEM培养基购于美国GIBCO公司；Peg-It病毒浓缩液、miR-20b慢病毒构建及包装相关质粒购于美国SBI System Biosciences公司。构建miR-20b慢病毒表达载体，点突变miR-20b与靶基因结合的种子序列而构建得到对照载体。

1.2 动物分组与造模 将小鼠随机分成模型组16只、对照慢病毒组18只、miR-20b慢病毒组18只。模型组正常饲养，对照慢病毒组、miR-20b慢病毒组分别给予2×107U重组慢病毒对照载体和miR-20b慢病毒表达载体尾静脉注射。7 d后三组均经尾静脉注射ConA 15 mg/kg诱导自身免疫性肝炎模型。

1.3 血清ALT水平检测 采用赖氏法。取模型组7只、对照慢病毒组9只、miR-20b慢病毒组9只小鼠，于造模后6、12、18、24、36、48 h分别眼静脉取血，离心取血清。样品孔和对照孔各3个复孔，每孔加5 μL血清。样品孔加入25 μL基质液，对照孔不加。配制标准品溶液，每个浓度3个复孔，加入96孔板中，37 ℃恒温水浴30 min。水浴后，所有孔均加入25 μL二硝基苯肼，对照孔再加入25 μL基质液，37 ℃恒温水浴20 min。水浴后，所有孔均加入250 μL 0.4 mol/L NaOH终止反应。多功能酶标仪读取波长在490 nm处吸光度值，按照标准曲线计算出血清样品中酶活力单位。

1.4 肝组织病理学检查 采用HE染色法。造模后18 h，三组分别取2只小鼠处死，留取肝组织(主要病变区)。加入4%甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，切成5 μm厚的切片。用玻片将蜡带捞起，并使其贴在玻片上。晾干后进行HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察组织病理情况。

1.5 血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平检测 采用ELISA法。造模后2 h，三组分别取剩余的9只小鼠，摘眼球取血，离心取上清液。ELISA检测前1日，酶标板每孔加100 μL包被抗体，4 ℃过夜。次日每孔加入300 μL PBST洗板4次。每孔加入200 μL封闭液，室温振荡200 r/min，60 min。洗板4次，每孔加入100 μL血清及标准品，振荡120 min。洗板4次，每孔加100 μL 二抗，振荡60 min。洗板4次，每孔加100 μL 辣根过氧化物酶，振荡30 min。洗板5次，每孔加100 μL底物，室温避光孵育10～30 min。每孔加100 μL终止液，多功能酶标仪读取波长在450 nm处吸光度，根据标准曲线计算IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平。

1.6 肝组织IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表达水平检测 采用实时荧光定量PCR法。小鼠摘眼球放血后，留取肝组织。采用TRIzol法提取肝组织RNA，反转录合成cDNA。将获得的cDNA按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书方法扩增目的基因。引物序列：GAPDH上游5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游5′-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3′；IFN-γ上游5′-CACAGTCATTGAAAGCCTAGA-3′，下游5′-TTGCCAGTTC-CTCCAGATAT-3′；TNF-α上游5′-CTACTGAACTTCGGG-GTGAT-3′，下游5′-CAGGCTTGTCACTCG AATT-3′；IL-17A上游5′-TGAAGGCAGCAGCGATCA-3′，下游5′-GGAAGTCCTTGGCCTCAGTGT-3′；IL-4上游5′-GAAAA-CTCCATGCTTGAAGAA-3′，下游5′-TCTTTCAGTGATGTGGACTTG-3′。反应条件：95 ℃ 3 min预变性；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，60～95 ℃缓慢升温25 min产生融解曲线。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 三组造模后不同时间点血清ALT水平比较 注射ConA后，模型组血清ALT水平6 h开始升高，18 h左右达峰值，48 h左右基本恢复。与对照慢病毒组相同时间点相比，miR-20b慢病毒组血清ALT水平降低(P均<0.05)；模型组与对照慢病毒组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.2 三组肝组织病理情况 模型组和对照慢病毒组肝组织有一定面积的坏死区域，同时伴有炎症细胞浸润和肝实质细胞坏死；miR-20b慢病毒组仅有炎症细胞浸润，未见明显坏死区域。

表1 三组造模后不同时间点血清ALT水平比较(U/L，x±s)

注：与对照慢病毒组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 三组血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平比较 与对照慢病毒组相比，miR-20b慢病毒组血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平降低(P均<0.05)；模型组与对照慢病毒组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 三组血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平比较

注：与对照慢病毒组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.4 三组肝组织中IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表达比较 与对照慢病毒组相比，miR-20b慢病毒组肝组织中IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表达水平降低(P均<0.05)；模型组与对照慢病毒组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 三组肝组织IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表达比较(x±s)

注：与对照慢病毒组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

肝脏是人体的一种特殊器官，以代谢功能为主，负责清除体内毒性产物、储存糖原、合成蛋白等；同时也是重要的免疫器官，具有独特的免疫微环境，富含大量免疫细胞，可识别外来毒素或病原微生物，通过免疫应答清除外来有害物质。肝脏是胸腺以外T细胞分化的重要场所，参与机体固有免疫应答和适应性免疫应答。自身免疫性肝炎以淋巴细胞、浆细胞浸润为主要病理特征，其临床表现包括高γ-球蛋白血症、血清转氨酶升高和自身抗体阳性等，其引起的急慢性肝损伤最终可导致肝纤维化、肝癌等高风险疾病。由于肝脏的免疫细胞间通过细胞因子、黏附分子及细胞间直接相互作用而形成一种独特的网络，因此深入研究肝脏的免疫调控机制尤为重要。研究表明，ConA、脂多糖、聚肌胞苷酸等均可诱导小鼠自身免疫性肝炎[3，9，10]。ConA所诱导的自身免疫性肝炎主要由NKT细胞、CD4+T细胞和Kupffer细胞介导[3，11，12]，同时大量细胞因子也参与到免疫应答之中，介导肝损伤的细胞因子主要包括IFN-γ、TNF-α、IL-4等；而IL-10、IL-15、IL-33等细胞因子起到负性调节作用[13]。

miRNAs参与多种病理及生理过程，可调控固有免疫应答和适应性免疫应答。miR-20b属于miR-106a-363基因簇成员，位于人和小鼠的X染色体上[5]。研究显示，miR-20b可能参与某些癌症的发生发展过程，包括肝癌、乳腺癌和胃癌等[14,15]。我们的前期研究表明，在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，miR-20b可能通过抑制靶基因RORγt和STAT3的表达，从而抑制Th17细胞的分化，可延缓实验性自身免疫性脑脊髓炎的疾病进程[16]。但是目前有关miR-20b在自身免疫性肝炎中的作用机制尚不完全清楚。本研究结果显示，ConA诱导小鼠自身免疫性肝炎后，血清ALT水平6 h开始升高，18 h左右达峰值，48 h左右基本恢复，表明自身免疫性肝炎模型建模成功。与注射对照慢病毒组小鼠相比，注射miR-20b慢病毒小鼠血清ALT水平显著降低，表明miR-20b在抵抗ConA诱导的小鼠自身免疫性肝炎过程中发挥重要作用。

组织病理切片显示，模型组和对照慢病毒组小鼠肝组织有一定面积的坏死区域，同时伴有炎症细胞浸润和肝实质细胞坏死；而注射miR-20b慢病毒组小鼠肝组织仅有炎症细胞浸润，并未见明显坏死区域，组织病理切片与血清ALT水平变化基本一致。

ConA所诱导的自身免疫性肝炎过程中，介导肝损伤的炎症因子主要包括IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-17A等[3]。本研究结果显示，与注射对照慢病毒组小鼠相比，注射miR-20b慢病毒组小鼠血清及肝组织中炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4表达水平显著降低，表明miR-20b对ConA诱导的自身免疫性肝炎进程中的炎症反应具有一定的抑制作用。

综上所述，miR-20b对自身免疫性肝炎小鼠的肝脏组织具有一定的保护作用，其机制可能是通过抑制炎症反应从而降低肝损伤水平，其具体调控机制及相关靶基因有待进一步研究。