急性胰腺炎患者尿液蛋白质组学分析

杨妮，白郑海，邱晓娟，杨宁，张丽，武苗苗，裴红红，张正良

(西安交通大学第二附属医院，西安710000)

急性胰腺炎(AP)是因胰蛋白酶消化自身胰腺组织而引起的严重的急性腹部病症。大多数AP患者病症较轻，并无并发症发生，然而约有20%的患者伴有炎症反应、继发感染等多种并发症，且症状较重，病死率较高[1]。目前对于AP的诊断主要通过测定血清淀粉酶、尿胰蛋白酶原-2、降钙素原、IL-6等，但不同的检测标志物均存在患者适用、诊断试剂等不同的条件限制[2～4]。寻找更为有效的生物标志物对AP的早期诊断和预后具有重要意义。蛋白质组学技术是从蛋白质整体水平探讨正常与病理条件下蛋白谱表达差异，为寻找各种疾病早期特异性生物标志物提供了基础[5]。本研究采用非标记质谱定量蛋白质组学技术分析AP患者与正常人尿液中蛋白谱表达差异，为筛选AP生物标志物提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1～3月我院收治的AP患者15例(AP组)，男8例、女7例，年龄27～79(50.5±15.0)岁，体质量(63.9±7.8)kg，肌酐(66.3±18.3)μmol/L，尿素氮(4.5±2.1)mmol/L。均符合AP诊治指南(2014版)诊断标准[6]，无其他严重并发症。排除住院期间死亡及合并其他严重疾病者。对照组为15例查体健康者，男8例、女7例，年龄25～77(48.6±17.0)岁，体质量(61.7±11.3)kg。本研究经由西安交通大学附属医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂 垂直电泳仪(英国GE-Healthcare公司)；Q-Exactive质谱仪(美国Thermo Finnigan公司)；EASY-nLC1000液相色谱(美国Thermo Finnigan公司)。

1.3 样品收集与总蛋白质提取 收集受试者入院时的尿液样本，AP组与对照组各随机分为3个小组，每小组5例样本混合成为一份标本，离心取上清，3 kD超滤管超滤浓缩。采用100 mmo/L碳酸氢铵溶液清洗3次，离心浓缩至200 μL，加入100 μL SDT裂解液，沸水浴15 min后，超声处理。采用BCA法测定蛋白质浓度。

1.4 蛋白质质量检测 每组样品各取10 μL，按体积比5∶1加入5×上样缓冲液，沸水浴5 min，14 000 g离心10 min，取上清，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析。电泳分离后进行考马斯亮蓝染色、脱色，分析蛋白条带，检测所提取蛋白样品的质量。

1.5 差异表达蛋白的筛选与鉴定 采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)和生物信息学分析法。通过超滤、FASP酶解、萃取、离心、脱盐、HPLC分离等步骤，采用Q-Exactive系统进行质谱分析。将LC-MS/MS原始文件导入Maxquant软件进行数据库搜索，数据库为uniprot_homo sapiens_181611_20170713.fasta。所得文件采用Perseus1.3.0.4软件进行分析，采用IBAQ算法进行定量分析，蛋白定性筛选标准为错误发现率(FDR)<0.01。组间蛋白差异采用t检验，以>2或<0.5差异倍数为差异表达蛋白。数据分析采用SPSS16.0统计软件。差异蛋白质通过GO数据库(David 6.7和QuickGO)进行GO功能注释分析，用KEGG软件进行通路分析，用perseus软件进行聚类分析。选取上步筛选出的差异表达蛋白，采用Western blotting法测量其在AP组和对照组中的表达情况，验证蛋白质组学分析结果。

2 结果

2.1 两组差异表达蛋白筛选结果 共发现334个蛋白质，其中57个蛋白存在差异表达，AP组有28个蛋白表达上调，29个蛋白表达下调(表1、2)；另外有9个蛋白只在AP组表达，73个蛋白只在对照组表达(表3、4)。

表1 AP组中发生上调的蛋白表达谱(前10位)

2.2 差异表达蛋白的功能活性分析结果

2.2.1 GO功能分析 将差异蛋白进行GO功能分析，结果显示差异蛋白所参与生物学过程主要为对刺激的应答、免疫、代谢以及其他细胞生物学过程的调控等，分子功能则以结合与催化活性为主，而差异蛋白质细胞组分分析主要定位于细胞膜、细胞器以及细胞外区域。

2.2.2 KEGG通路分析 将差异蛋白进行KEGG通路分析，共发现9个有统计学意义的代谢通路，分别是细胞黏着紧密连接通路、溶酶体激活通路、细胞凋亡通路、细胞外基质受体互作通路、补体及凝血级联反应通路、白细胞跨内皮迁移通路、系统性红斑狼疮通路、神经胶质瘤通路、心律失常性心肌病等相关通路。

表2 AP组中发生下调的蛋白表达谱(前10位)

表3 只在AP组表达的蛋白

表4 只在对照组表达的蛋白(前10位)

2.3 显著差异蛋白的筛选与鉴定结果 根据蛋白表达差异倍数及GO、KEGG分析结果，发现糖蛋白CD59、免疫球蛋白重链IGHA2被富集在差异最显著的类别(细胞膜、细胞器、细胞外区域以及结合活性)。经Western blotting检测，AP组尿液中CD59蛋白表达较对照组升高，IGHA2蛋白表达较对照组降低(P均<0.05)。见表5。

表5 AP组与对照组尿液中CD59、IGHA2蛋白表达水平比较

注：与对照组比较，*P均<0.05。

3 讨论

AP的发病机制涉及胰腺自身消化、炎症介质、肠道细菌易位、细胞凋亡等许多过程。病变过程中，机体免疫系统以及各类细胞因子均参与反应，各类因子及中间介质在血液、尿液等体液中的含量也会发生变化[7～9]。因此，这些蛋白因子的水平变化或可为寻找更为有效的AP生物标志物带来新的方向[10～13]。本研究采用非标记质谱定量蛋白质组学技术分析AP患者与正常人尿液中蛋白谱表达差异，结果显示，糖蛋白CD59、免疫球蛋白重链IGHA2被富集在差异最显著的类别，这两种蛋白有望成为AP的特异性生物标志物。

CD59是位于细胞表面的糖蛋白，可通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)结合于细胞膜，在各类造血细胞、组织细胞、胎盘等多种类型细胞表面均有存在，并广泛游离分布于唾液、尿液、泪液等体液中。已知CD59的功能多样，其主要功能与补体活化的调节有关[14]。CD59作为一种膜结合补体调节蛋白，可在补体级联反应的末段，与补体攻膜复合物中的C8和C9相互作用而结合，阻止补体攻膜复合物的形成，从而抑制补体的活化过程。此外，CD59蛋白也参与T细胞黏附、信号转导等过程的调控[14]。本研究发现，CD59蛋白在AP患者尿液中的表达水平高于正常对照者。Lindström等[15，16]报道，在重症AP患者的血清中，补体调节蛋白CD59水平明显上升，表明CD59水平增高可能与AP的发生存在正向关系。此外，CD59蛋白被发现在多种病理条件下均呈现出高水平表达趋势。已有研究发现，在膀胱癌基质细胞、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤等病变组织中均能检测到CD59蛋白高表达，其可能参与肿瘤形成过程中逃避补体攻击及炎症反应的作用[14，16]。

补体是机体内重要的免疫调节及防御机制，可介导机体免疫防御反应，也可发挥溶解细胞作用，杀伤病损细胞，是体内重要的效应放大系统[17]。本研究结果显示，AP患者尿液中差异表达的蛋白质也参与补体及凝血级联反应通路，说明补体系统在AP发病过程中扮演着重要作用。因此，AP患者尿液中CD59蛋白水平的升高或与患者体内补体防御机制的受损有关。

机体免疫功能的改变也与AP的发生密切相关。本研究发现，免疫球蛋白重链在AP患者尿液中的表达水平较正常对照者下降。已有研究证实，AP的预后以及其他并发症的发生、病情的转归等均与免疫功能变化有关[11]。单核细胞、T淋巴细胞以及多种白介素等均参与胰腺炎的病理学过程，其中炎症介质IL-6被证明为AP诊断的有效因子之一，可在AP患者入院12～24 h内检出，且在重症AP患者中具有较高的敏感性及特异性[2]。而免疫球蛋白在细胞膜、细胞器、细胞外区域以及结合活性等方面均存在作用，其表达水平的变化对急性炎症疾病的发生具有重要作用。因此推测，免疫球蛋白重链或可作为AP的潜在生物标志物，以反映胰腺炎患者免疫功能的改变。

此外，本研究发现在AP患者与正常人群的尿液中存在较大的蛋白表达差异，有数十种蛋白发生显著的表达上调或下调，也有许多蛋白只在正常人群或AP患者尿液中出现，例如胰分泌性胰蛋白酶抑制子SPINK1、泌乳素诱导蛋白PIP、凝血因子Ⅹ、补体相关因子CFHR2/CFD、以及载脂蛋白D、磷酸肌醇3激酶、谷氨酰胺酰肽环转移酶、谷氨酰氨基肽酶、羧肽酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、脱氧核糖核酸酶、绒毛膜促性腺激素、胸腺素等与糖/脂/蛋白质代谢、激素分泌等相关的蛋白物质。这些差异表达的蛋白主要定位于细胞膜、细胞器以及细胞外区域，参与了细胞连接、细胞凋亡、细胞外基质调控、补体及凝血级联反应、细胞粘连/迁移、溶酶体激活等细胞学过程的调控，在AP病变过程中发挥着基础的级联和促进作用，是病变发生的主要分子基础。对这些差异表达蛋白功能的深入研究有助于探明AP的发病机制、寻找合理的诊断和治疗手段。

综上所述，AP患者与健康人的尿液蛋白质谱存在差异，糖蛋白CD59、免疫球蛋白重链IGHA2可能作为AP的特异性生物标志物。本研究也证实，采用非标记定量蛋白质组学技术寻找AP的潜在生物标志物是有效和可行的，通过蛋白质组学分析，为进一步探索AP诊断标记物提供了方向。