口腔种植体周围炎龈沟液中IL-6和NF-κB的表达分析

李洪波 黄 鹤 李巧梅 石 磊

1.南方医科大学深圳口腔医院 深圳牙科医疗中心，广东深圳 518001；2.深圳市人民医院，广东深圳 518020

种植体周围炎在临床上口腔科较为常见，发生率约为28%～56%，是指发生于种植体周围软硬组织的炎症，常导致种植体骨结合失败、支持骨丧失，甚至可导致种植体松动脱落。目前临床上关于其发病机制尚未明确，多认为与微生物侵袭种植周围组织所致。探讨种植周围炎发病机制，为临床种植体周围炎的防治提供指导是目前面临的主要课题。本研究通过2015年4月～ 2016年4月期间我院接收的120例在我院进行种植义齿治疗的患者资料进行回顾性分析，探讨IL-6及NF-κB表达在种植体周围炎发生发展中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取120例在我院进行种植义齿治疗的患者，入院时间为2015年4月～2016年4月，其中女47例，男73例，年龄22～65岁，平均（45.3±2.1）岁，病程2～10年，平均（5.8±1.2）年，共有126颗种植牙，以种植体周围是否发生炎症分为炎症种植体组45例（51颗），其中女20例，男25例，年龄22～64岁，平均（45.2±1.8）岁，病程3～10年，平均（6.3±1.2）年，健康种植体组75例（75颗），其中女27例，男48例，年龄23～65岁，平均（45.3±1.9）岁，病程2～8年，平均（6.2±1.3）年。种植体周围炎组根据种植体周围炎疾病分类标准分为三组，即轻度种植体周围炎组15例（轻度组，15颗）、中度种植体周围炎组19例（中度组，20颗）、重度种植体周围炎组11例（重度组，16颗），其中轻度组中，女6例，男9例，年龄22～62岁，平均（45.1±1.5）岁；中度组中，女9例，男10例，年龄23～64岁，平均（45.3±1.4）岁；重度组中，女5例，男6例，年龄22～63岁，平均（45.2±1.6）岁。把对侧同名健康天然牙为对照组60例（67颗），均为同期在我院进行体检的人群，其中女29例，男31例，年龄21～65岁，平均（45.3±1.9）岁。

1.2 纳入标准

患者研究前3个月内未进行免疫制剂、抗生素及非甾体类药物治疗；种植的义齿＞3个月；种植后进行口腔卫生的维护，依从性良好；种植义齿无咬合创伤；身体健康，且患者知情同意；无妊娠。

1.3 诊断标准[1]

近中或远中阴沟出血指数（SBI）≥1位点，菌斑指数（PLI）≥ 1，探诊深度（PD）≥ 3mm；（2）形成中牙周袋；（3）种植体松动；（4）X线显示种植体颈部有骨吸收投影区。轻度种植体周围炎：骨丧失深度＜25%种植体长度，PD≥4mm伴出血和（或）探诊溢脓；中度种植体周围炎：骨丧失深度25%～50%种植体长度，PD≥6mm伴出血和（或）探诊溢脓； 重度种植体周围炎：骨丧失深度＞50%种植体长度，PD≥8mm伴出血和（或）探诊溢脓。

1.4 采集和测量龈沟液

将Whatman3号滤纸裁剪成2mm×10mm滤纸条，消毒后于清洁微量离心管中称重后备用。将菌斑去除牙面擦干后，将滤纸条插入种植体和天然牙的牙冠远中、近中颊侧和舌（鄂）侧龈沟中，60s后取出放入原始EP管中称重。计算龈沟液质量（采集龈沟液质量与滤纸条质量的差值）。按比重（1mg/μL）换算为体积（μL）。将EP管中加入磷酸盐缓冲剂（PBS）200μL后，震荡1h，低温离心后取上层清夜于-80℃低温保存。

1.5 龈沟液NF-κB及炎症因子测量

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测量NF-κB及IL-6水平，试剂盒由武汉博士德生物技术有限公司提供。将-80℃ 保存的EP管取出后，常温解冻，在常温摇床上放置1h，加入100mL PBS中用于重新洗脱样品。在ELISA板处理前轻轻摇动试管1min，之后以转速5000rap在4℃下离心30min。严格按照ELISA试剂盒说明程序测定NF-κB和IL-6的样品含量。将使用的抗体放入在96孔微量滴定板中，孔中加入100μL的标准品和样品，并将板孵育18h。然后，将各孔洗涤5次，每孔加入0.35mL洗涤液。接着，将检测抗体（NF-κB抗体或IL-6抗体）加入至每个孔中，并在室温（18～25℃）下孵育1h。然后，各孔再洗涤5次。室温下streptavidin-HRP偶联物100μL孵化1h，各孔再洗涤。在室温下将100μL tetramethylbenzadine 联苯胺（TMB）各孔于黑暗中放置10min，用铝箔覆盖滴定板，停止反应，加入终止溶液100μL和颜色测定，以自动化微板分光光度计，设定为450nm，并且将样品与标准进行比较。然后数据计算并通过预定的标准曲线的插值的方法获得。

1.6 牙周学检测[2]

PLI：表面轻划可见菌斑计1分，表面无菌斑计0分，表面堆积大量软垢计3分。PD：使用牙周探针在近舌、远舌、近颊、远颊进行检测，探针平行于牙体长轴，紧贴牙根，用力轻柔，探针深入到龈沟底，对探针刻度进行记录。SBI：探诊未出血计0分，龈缘呈线状出血计2分，探诊有分散点状出血计1分，龈缘内重度或自发出血计3分。

1.7 统计学处理

表1 各组患者龈沟液及牙周血指标比较

表2 各组患者种植体与健康牙龈沟液中IL-6及NF-κB含量比较（±s ，ng/mL）

表2 各组患者种植体与健康牙龈沟液中IL-6及NF-κB含量比较（±s ，ng/mL）

注：与对照组、健康种植体比较，*P＜0.05；与重度组比较，#P＜0.05

组别 亚组 IL-6 NF-κB炎症种植体组 轻度组（n=15） 5.02±0.92*# 11.05±1.38*#中度组（n=20） 6.05±1.52*# 13.05±1.35*#重度组（n=16） 8.01±0.88* 15.32±1.35*健康种植体（n=75） 1.45±0.36 2.68±0.45对照组（n=67） 1.34±0.68 2.62±0.52 F 436.19 1662.51 P＜0.05 ＜0.05

2 结果

2.1 各组患者龈沟液及牙周血指标比较

炎症组、对照组及健康种植体中龈沟液含量、PD、SBI、PLI，经方差分析发现有统计学意义（P＜0.05），进一步两两比较发现，炎症组龈沟液含量、PD、SBI、PLI明显高于对照组及健康种植体（P＜0.05），对照组及健康种植体比较无统计学意义（P＞ 0.05），见表 1。

2.2 各组患者种植体与健康牙龈沟液中IL-6及NF-κB含量比较

健康种植体、对照组及炎症种植体组中的IL-6及NF-κB含量经方差分析显示有统计学差异，进一步两两比较发现，炎症种植组中的3个亚组龈沟液中NF-κB 、IL-6比对照组及健康种植体组的分泌水平高，且随着病情的加重，NF-κB及IL-6水平不断升高，见表2。

2.3 相关性分析

用Spearman法进行相关分析显示，种植体周围炎患者龈沟液中IL-6与NF-κB呈正相关（r=0.758，P=0.002）。

3 讨论

口腔种植体的应用使常规义齿修复效果得到较大程度的提高，提高患者的口腔功能和面部美观，得到越来越多人的认同。然而种植修复的成功率尚未达到100%，其中由宿主反应及口腔微生物感染引起的种植体周围炎，易引起种植体周围骨组织功能丧失，使种植体失去支撑作用，导致种植体修复失败。种植体周围炎是发生在种植体周围软硬组织的炎症，是种植修复后常见的并发症之一，其发生发展是类似于牙周病，是一个缓慢的不断进展的过程。临床上关于种植体周围炎的发病机制目前尚不清楚，导致临床治疗难度较大。目前多数学者认为[3-5]，种植体周围炎最主要的致病因子为微生物，微生物侵袭种植体周围组织，进而使组织遭受破坏所致。因此对种植体周围炎的发病机制进行深入探讨，寻求种植体周围炎各种新的治疗方法已成为当前口腔种植领域关注的焦点。本研究发现，炎症组患者龈沟液总量及PD、SBI、PLI明显高于对照组及健康种植体，表明炎症组种植体周围组织受到微生物感染，引发炎症反应，导致骨吸收和组织渗出液明显增加。

核转录因子NF-κB是一种特异结合蛋白，是由美国学者Baltimore及Sen在浆细胞与B细胞中发现[6]。活化的NF-κB与靶基因结合后可对其基因转录进行调节并促进多种炎性介质表达。研究发现[7]，NF-κB在炎性反应、免疫应答、细胞粘附及细胞生长与凋亡等方面发挥重要作用，在非活化状态下，NF-κB与IκB结合存在于胞质中，在外界因素刺激下，促使IκB降解、NF-κB解离，NF-κB激活后进入胞核，与特定基因的增强子或启动子上相应位点结合，对特定基因的转录具有调控作用，促使一系列炎症因子，如IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-8等的释放，从而引起局部或全身的炎症状态。研究显示[8]，NF-κB信号通路参与骨性关节炎、滑膜炎、骨质疏松、根尖周炎、牙周炎等疾病的发生发展过程。目前临床上关于NF-κB与种植体周围炎的研究尚处于起步阶段，仅见一篇相关报道，即李岩等选取5只成年杂种犬建立口腔种植体周围炎模型，通过ELISA方法检测NF-κB在成年杂种犬种植体周围炎中的表达，发现NF-κB在种植体周围炎的龈沟液中的表达相比健康的种植体周围龈沟液显著增多，提示NF-κB 参与种植体周围炎的发生、发展[9]。本实验通过研究NF-κB在人种植体周围炎中的表达情况，探讨NF-κB在种植体周围炎中的作用，以期为种植体周围炎治疗寻找新的靶点，结果显示，炎症种植体组的3个亚组龈沟液中的NF-κB 比对照组及健康种植体组的分泌水平高，且随着病情的加重，NF-κB水平不断升高，提示NF-κB参与种植体体周围炎的发生发展，能够反映龈沟液中炎症状态，该结论与上述文献报道一致[10]。

IL-6主要由单核-巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞产生，其可通过自分泌或旁分泌的方式，在免疫应答、造血功能调节等方面发挥功能作用。研究还发现[11]，其在骨吸收及破骨细胞形成中均发挥着重要的作用，其还能够上调破骨细胞中MPP-3的表达水平，使骨基质分解加速，促进骨质吸收。研究发现[12-14]，IL-6的表达与种植体周围炎的活动期呈线性相关。本研究中发现，炎症种植体组的3个亚组龈沟液中的IL-6表达水平比对照组及健康种植体组显著要高，且其水平随着病情加重而不断升高，推测IL-6参与炎症的发生发展，其可能通过增加种植体周围骨质吸收，导致种植义齿治疗的失败。本研究结果显示，IL-6、NF-KB参与种植体周围炎的发生发展，且IL-6与NF-κB水平呈正相关，提示NF-KB作为调控基因可能在疾病发生发展中对IL-6的表达进行调控，IL-6随着NF-KB的升高而增加。结合炎症细胞因子对破骨细胞作用的影响，并深入研究这些因子发挥作用的信号通路，可对其信号通路进行阻断，调控其表达，以达到控制炎症发展的目的，从而为种植体周围炎的临床防治提供更好地指导[15]。

综上所述，口腔种植体周围炎患者龈沟液中IL-6、NF-KB水平升高，IL-6、NF-KB可能参与疾病发生发展，能够反映炎症程度，二者在种植体患者龈沟液中呈正相关，为临床种植体周围炎的防治提供新的思路。