MTHFR基因多态性与阿托伐他汀钙治疗H型高血压疗效的相关性研究

徐占领

0 引言

进入本世纪以来，随着我国老龄化进程的加快，高血压的发病率一直居高不下，甚至出现逐年上升的趋势。国外有研究显示，同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)与心脑血管疾病尤其是高血压的发生密切相关[1]。《中国高血压防治指南2010版》中也指出，Hcy是诱发心脑血管疾病发生的新的危险因素[2]。因此，有研究者将人体血浆Hcy>10 μmol/L的高血压患者定义为H型高血压[3]。对于H型高血压患者的治疗，应在控制血压的同时，强调降低其Hcy水平。亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylene tetrahydmfolate reductase，MTHFR)是Hcy代谢过程中的一种关键酶，可促使5,10-MTHF转化为 5-MTHF，参与Hcy再甲基化过程[4]。因此，当MTHFR发生遗传缺陷时，血浆Hcy水平会异常升高。近年来，随着医学水平的发展，从遗传学角度探讨基因突变与高血压发病机制的相关性已经成为心血管领域的研究热点。有研究显示，我国人群MTHFR基因C667T遗传突变率较高，在环境和遗传双重因素的影响下，我国75%以上的高血压患者都属于H型高血压[5]，因此，探讨MTHFR基因C667T单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)与降压药物疗效之间的关系，对于采取个体化治疗具有重要的临床价值。阿托伐他汀钙属于新型羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA)抑制剂，研究显示，阿托伐他汀钙可能通过降低血清Hcy浓度发挥内皮保护作用[6]。本研究旨在探讨H型高血压患者接受阿托伐他汀钙治疗后血浆Hcy的变化，及其与MTHFR C667T基因多态性的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1月至2017年10月在我院心内科住院或门诊就诊的H型高血压患者476例，其中男257例，女219例；年龄39～81岁，平均年龄(58.67±8.19)岁。采集血液样本测定Hcy含量，所有患者Hcy≥10 μmol/L。按照随机数字表法，将患者分为对照组(212例)和观察组(264例)。两组患者的年龄、性别比例、平均病程、体重指数(Body mass index，BMI)、平均收缩压(Systolic blood pressure，SBP)、平均舒张压(Diastolic blood pressure，DBP)等一般临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本项研究已获得我院伦理委员会批准。见表1。

1.2 受试者入选标准 ①所有患者均符合《中国高血压防治指南2010版》关于原发性高血压的诊断标准：收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg；②所有患者遵循自愿原则，并签署知情同意书。

1.3 受试者排除标准 ①不符合上述纳入标准的受试者；②合并恶性肿瘤者；③合并器质性心脏病变者；④合并有血液系统疾病、免疫系统疾病、内分泌疾病或急性感染者；⑤合并其他严重疾病者；⑥受试前1个月内服用叶酸、维生素B及其他影响维生素代谢的药物者；⑦受试前1个月服用他汀类药物者等。

1.4 治疗方案 所有患者采用常规降压药物治疗，包括钙离子拮抗剂、β受体阻断剂、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、AT1受体拮抗剂等。观察组患者在常规降压药物治疗的基础上加服阿托伐他汀钙(立普妥，辉瑞制药有限公司，国药准字H20051407，10 mg/片) 20 mg/次，1次/d。连续治疗12周。

1.5 研究方法

1.5.1 样本采集 采集所有受试者清晨空腹时的外周静脉血5 ml，其中1 ml置于含有依地酸二钠(EDTA-Na)抗凝剂的采血管中，用于检测生化指标；其余血液样本于-70 ℃低温保存，用于进行DNA提取。

1.5.2 血压测量 所有患者均在每日8∶00～22∶00采用欧姆龙医用电子血压计测量坐位血压，每日测量3次，取平均值。

1.5.3 生化指标检测 由我院检验科采用迈瑞BS350全自动血液生化分析仪(中国迈瑞)检测患者血糖、血脂、Hcy等生化指标。△Hcy=治疗前Hcy水平-治疗后Hcy水平。

1.5.4 引物设计与合成方法 根据NCBI数据库获得的资料设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。见表2。

1.5.5 MTHFR C677T基因多态性检测方法 ①DNA提取：采用基因组DNA小量抽提试剂盒(由北京天根生物技术有限公司提供)。具体提取方法参照说明书进行。②采用紫外分光光度法测定DNA质量和浓度。③进行PCR-RELP：取8 μlPCR扩增产物，加入2 μl 10×Buffer和1 μl特异性限制性内切酶(购自大连宝生生物工程有限公司)，然后加入9 μl去离子水，于37 ℃反应12～14 h。④将PCR产物进行电泳检测。⑤基因测序：将50 μl测序样品送至上海生工生物工程有限公司进行纯化测序；确定为目的片段后，进行大批量扩增，电泳，酶切，确定基因型。

表1 患者一般临床资料(例)

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件，每一等位基因出现的频率采用直接计数法进行计算；符合正态分布的计量资料采用独立样本t检验进行两组间的数据比较；计数资料以率(%)表示，数据比较采用χ2检验。采用Logistic多元回归分析确定MTHFR基因多态性与Hcy水平的关系。并采用系列模型校正相关危险因素，其中以单因素回归中P<0.05的指标为标准选择协变量建立线性回归模型。统计学显著性差异检验均为双侧。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者生化指标比较 两组患者总胆固醇水平、三酰甘油、空腹血糖值及Hcy水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表3。

2.2 两组患者MTHFR C677T基因型及等位基因分布频率比较 观察组患者MTHFR C677T基因多态性分布频率为21.97%CC、47.73%CT、30.30%TT，对照组为23.11%CC、46.70%CT、30.19%TT，两组患者均以杂合型CT型为最多见；观察组患者等位基因频率分别为45.83% C、54.17% T，对照组为46.46% C、53.54% T，其中以等位基因T为最多见。两组患者MTHFR C677T多态性的基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.3 不同基因型H型高血压患者治疗前后血浆Hcy水平 治疗前，两组TT型高血压患者血浆Hcy水平高于CC型和CT型患者(P<0.05)；治疗12周后，两组3种不同基因型患者平均血浆Hcy水平均降低(P<0.05)。其中两组TT型患者平均血浆Hcy水平仍然高于CC型和CT型患者(P<0.05)；但是观察组TT型患者Hcy下降幅度大于CC型和CT型患者(P<0.05)；而对照组3种基因型患者Hcy下降幅度基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

2.4 MTHFR基因单倍体型与阿托伐他汀钙对Hcy水平降低作用的相关性 经单因素Logistic回归分析显示，MTHFR基因C677T位点突变型TT及阿托伐他汀治疗是影响Hcy变化量的因素(OR=1.114，95%CI:1.068～1.372，P<0.05；OR=0.897，95%CI:0.635～0.912，P<0.05)。此外，为了排除各种因素对Hcy变化量的影响，笔者采用系列模型进行校正，包括模型1(校正了年龄、性别、病程、BMI)、模型2(校正了SBP、DBP、总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、Hcy)。最终，以单因素分析中P<0.05的变量作为协变量构建模型3。经多元Logistic回归分析结果显示，校正其他独立危险因素，MTHFR C677T基因位点TT型突变和是否加服阿托伐他汀钙对于降低H型高血压患者血浆Hcy水平具有交互作用(P<0.05)。见表6。

表2 MTHFRC677T基因SNPs分析

表3 两组患者生化指标比较(mmol/L)

表4 MTHFR C677T基因多态性基因型及等位基因频率分布(例，%)

3 讨论

目前，心脑血管疾病已经成为全球性问题，而高血压是心脑血管疾病发生的重要危险因素。高血压的发病因素复杂且多样化，大量研究显示，血浆Hcy水平升高是高血压发生的独立危险因素[7]。目前国际上将Hcy>10 μmol/L的原发性高血压患者定义为H型高血压。在我国，高血压患者血浆Hcy水平普遍高于国外高血压患者的平均水平，因此，大部分原发性高血压患者均伴有高Hcy血症，尤其是男性高血压人群中，H型高血压患者的比例甚至高达90%以上[8]，据推测可能的原因包括环境因素、饮食习惯及遗传因素等。Hcy并非自身合成，而是主要来源于食物中摄取的蛋白质，是蛋氨酸水解过程中的中间产物，其中亚甲基四氢叶酸还原酶与Hcy代谢密切相关[9]。有研究显示，我国人群MTHFR C677T TT基因携带率较高，对代谢酶的活性影响较大，血浆Hcy的整体水平相对偏高[10]。因此，有效地控制血浆Hcy水平对于降低心脑血管疾病的发生风险具有重要意义。

目前，在我国临床上主要采取钙离子拮抗剂、β受体阻断剂、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂、AT1受体拮抗剂等进行降压治疗，但是对于血浆Hcy水平的改善作用并不明显。阿托伐他汀钙是一种新型的人工合成的降压调脂药物，对血管内皮功能有明显的改善作用[11]。研究显示，阿托伐他汀钙可降低血浆Hcy水平以及Hcy引起的氧化应激反应，从而保护血管内皮[12]。而MTHFR基因是H型高血压疾病遗传易感性的重要基因，其是否与阿托伐他汀钙降低Hcy水平有密切关系是本项研究的主要目的。

表5 两组不同基因型患者治疗前后血浆Hcy水平(μmol/L)

注：*与突变型TT组比较，P<0.05

表6 经多元Logistic回归分析MTHFR基因型与Hcy水平变化的相关性(△Hcy作为因变量)

注：模型1，校正了年龄、性别、病程、BMI；模型2，校正了SBP、DBP、总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、Hcy；模型3，校正了年龄、性别、病程、BMI、SBP、DBP、总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、Hcy

近年来，随着分子生物学的发展，尤其是基因组计划和后基因组计划研究工作的深入开展，为探讨高血压个体化治疗的遗传学机制提供了新的思路和方法。1995年，由Frosst等[13]学者首次发现MTHFR C677T配体结合域存在功能性氨基酸变异现象，可影响Hcy代谢酶的活性，MTHFR C677T突变是目前发现的MTHFR基因最常见的不耐热突变位点。有研究证实，MTHFR C677T基因CT型和TT型酶活性较CC基因型明显降低，从而导致血浆Hcy水平升高[14-15]。基于前期报道，本项研究着重探讨了MTHFR C677T基因多态性与阿托伐他汀钙对H型高血压患者血浆Hcy降低作用的相关性。结果显示，治疗前，TT型患者血浆Hcy水平高于CC型、CT型患者，提示H型高血压人群中MTHFR基因677C/T纯合突变TT基因型可能是Hcy升高的重要遗传因素。H型高血压患者接受阿托伐他汀钙治疗后，血浆Hcy水平明显降低，尤其是TT型患者血浆Hcy水平降低最为明显，与CC型、CT型患者血浆Hcy平均降低幅度比较，差异有统计学意义。经二元Logistic回归分析，MTHFR C677T基因位点TT型突变是阿托伐他汀钙降低H型高血压患者血浆Hcy水平的重要影响因素。

由于H型高血压发病机制复杂且与遗传因素密切相关，不同种族、地区的人群基因背景也不甚相同，所以MTHFR C677T基因多态性与降压药物疗效的相关性尚待进一步确证。但是本研究在一定程度上反映了阿托伐他汀钙对于携带有MTHFR C677T基因位点TT型突变的H型高血压患者的血浆Hcy水平有明显的降低作用，从而为H型高血压患者的个体化治疗提供了一定的证据支持。