一点红对STZ致2型糖尿病大鼠肾脏保护作用机制研究

冯协和，李 聪，王 珊，刘 菁

0 引言

近年来，作为糖尿病的主要并发症之一，糖尿病肾病的发病率升高[1]。糖尿病肾病的肾脏损害包括内部的肾小管、肾小球、肾间质以及内部血管病变等，随着病变程度的加重，最终会导致肾脏纤维化乃至肾衰竭[2]。目前，糖尿病肾病的发病机制尚不明确，其发病可能是由代谢紊乱、细胞生长因子、遗传和氧化应激等多因素综合作用的结果[3]，因此，如何延缓糖尿病肾病的进展越来越受到关注。有报道，糖尿病肾病的特点是骨形态发生蛋白(BMP-7)的表达下降和肾小球足细胞数目和分化降低，同时，伴随体内转化生长因子β1(TGF-β1)的表达增强[4]。有报道，BMP-7可以逆转TGF-β1介导的肾小管上皮细胞分化，从而改善肾功能，抑制肾纤维化[5]。一点红为菊科植物一点红Emiliasonchifolia(L.) DC的全草，味苦、性凉，具有清热解毒、散瘀消肿的作用，主治上呼吸道感染、口腔溃疡、肺炎、乳腺炎、肠炎、菌痢、尿路感染、疮疖痈肿、湿疹、跌打损伤等[6]。研究表明，其可以降低链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠的血糖，改善氧化应激，纠正糖脂代谢紊乱，保护胰岛细胞[7]。本实验进一步研究一点红对STZ致糖尿病大鼠肾脏的保护作用，及其对肾组织中TGF-β1和BMP-7表达的影响，探讨一点红对糖尿病模型大鼠肾脏保护作用的机制，为降糖新药制剂的开发及后期的临床应用奠定基础。

1 材料

1.1 药材与试剂 一点红购自神农本草中药饮片有限公司。厄贝沙坦片[安博维APROVEL，0.15 g，赛诺菲(杭州)制药有限公司，国药准字J20130049]；链脲佐菌素(美国Sigma公司，批号：SLBB8126V)；血糖试纸条(美迪信，批号：SPF16Z5B3)；TGF-β1、BMP-7免疫组化试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)。其余试剂均为分析纯。

1.2 动物 6～7周龄清洁级SD大鼠60只，雄性，体重220～240 g，由湖北医药学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(湘)2009-0004。饲养室温度及相对湿度适宜，并且给予12 h光照和黑暗循环。自由摄食和饮水，适应性饲养7 d后用于实验。

1.3 仪器 BS2202S电子天平(Sartorius仪器公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，超纯水系统(南京集水环保科技)，美迪信血糖仪(天津亿朋医疗器械有限公司)，全自动生化分析仪(南京普朗生物技术有限公司)，Sigma离心机(美国Sigma公司)，显微镜(日本奥林巴斯株式会社BX51)，切片机(德国徕卡)。

2 方法

2.1 供试品的制备 称取1 kg一点红药材置10 L 的圆底烧瓶中，加入6 L纯化水，加热回流提取2 h，过滤取续滤液，在45 ℃下减压浓缩为黑色浸膏，冰箱冷冻储存，使用时采用纯化水溶解稀释至所需灌胃量。

2.2 2型糖尿病大鼠模型建立及分组 从适应性喂养7 d后的60只大鼠中，随机选择10只大鼠作为正常对照组，其余50只作为糖尿病造模动物。正常对照组大鼠用正常普通饲料喂养，模型组用高糖高脂饲料喂养2周后，禁食12 h，腹腔注射链脲佐菌素溶液(35 mg/kg)进行造模。高脂高糖饲料继续饲养1周，禁食12 h，尾静脉采血测定大鼠空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol/L为2型糖尿病大鼠造模成功[8]，造模成功率为72%。从造模成功的糖尿病大鼠中选取体重和血糖相当的30只，分别作为模型组、厄贝沙坦组、一点红提取物组，每组10只，模型组观察期间死亡2只，余8只继续进行实验。

2.3 给药方法 根据分组情况，厄贝沙坦组给予厄贝沙坦0.015 8 g/kg进行灌胃(按人体每日服用0.15 g转化为大鼠用量所得)，一点红提取物组按10 g/kg进行灌胃，正常对照组和模型组均给予等体积的纯化水进行灌胃。各组大鼠均每日灌胃1次，给药4周。实验期间均给予标准饲料喂养，不给予胰岛素及其他降血糖干预。

2.4 观察指标

2.4.1 一般状况观察 对大鼠的一般状况(精神状态、活动情况、体重、毛色、进食、饮水、排泄等)进行观察。

2.4.2 各组大鼠24 h的饮食量、饮水量及尿量记录 在实验结束的前1 d,记录各组大鼠24 h的饮食量和饮水量，采用代谢笼法收集24 h的尿液并记录。

2.4.3 各组大鼠尿液生化指标的测定 将实验结束前1 d收集的各组大鼠的尿液，取1 ml置1.5 ml的EP管中，3 000 r/min 离心5 min后得上清液，将上清液置自动生化测定仪中测定24 h尿蛋白总量(UPro)、24 h尿白蛋白总量(UAlb)、尿肌酐(Ucr)，采用冰点渗透压测定仪测定尿液渗透压(UOP)。

2.4.4 各组大鼠血液生化指标的测定 取全血经3 000 r/min离心机离心得血清，用全自动生化分析仪测定血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、尿酸(UA)、白蛋白(Alb)和三酰甘油(TG)，采用无创尾动脉血压测量系统检测大鼠尾动脉收缩血压。

2.4.5 各组大鼠体重和肾脏肥大指数的测定 各组大鼠在末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h，称重后用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射，麻醉大鼠后处死，迅速切取双肾，滤纸吸干血液，天平精确称重，计算肾脏肥大指数(Kidney hypertrophy index，KI)：KI=(肾重/体重)×100%。取部分留待肾组织病理切片和免疫组化用，其余装于冻存管中，放置-80 ℃冰箱保存。

2.4.6 各组大鼠肾脏病理切片染色检查 取肾组织置于10%中性甲醛固定液中24 h，分别用流水充分冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，常规病理切片，制成2 μm石蜡切片，HE、PAS染色于光镜下观察。

2.4.7 各组大鼠肾组织中TGF-β1和BMP-7免疫组化检测 取部分肾组织置于10%中性甲醛固定液中48 h，分别用流水充分冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，常规病理切片，制成4 μm石蜡切片，70 ℃烘4 h，脱蜡入水，抗原热修复，清除内源性过氧化酶，滴加山羊血清封闭，分别滴加2个抗体，孵化后4 ℃过夜，在切片上滴加生物素二抗，DAB显色，苏木素复染细胞核，水洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片。阳性为出现棕黄色着色。每个切片含10个高倍视野(400×)，采用Image pro plus 6.0软件做半定量分析，用平均吸光度值(累积吸光度/测量面积)表示TGF-β1和BMP-7的表达。

3 结果

3.1 一般状况观察 正常对照组大鼠饮水和进食均比较正常，精神状态良好，反应灵敏，皮毛光泽，体重增长，无死亡；模型组大鼠反应迟钝，皮毛杂乱无光泽，体重下降，排尿增多，每日均需更换垫料，粪便稀，且饮食量和饮水量明显增加，实验期间有2例死亡，可能是高血糖使多脏器衰竭致死；厄贝沙坦组与一点红提取物组大鼠饮食、饮水和排泄情况较模型组均有所改善，毛色尚可，反应能力明显增强，活动量有所增加，观察期间均无死亡。

3.2 各组大鼠24 h饮食量、饮水量及尿量比较 与正常对照组比较，模型组、厄贝沙坦组、一点红提取物组大鼠24 h的饮食量、饮水量及尿量均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，厄贝沙坦组和一点红提取物组大鼠24 h的饮食量、饮水量及尿量均显著降低(P<0.05)；一点红提取物组大鼠24 h的饮食量、饮水量及尿量与厄贝沙坦组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

3.3 各组大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr及尿液渗透压比较 与正常对照组比较，模型组、厄贝沙坦组、一点红提取物组大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr均显著升高(P<0.05)，UOP显著降低(P<0.05)；与模型组比较，厄贝沙坦组和一点红提取物组大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr均显著降低(P<0.05)，UOP显著升高(P<0.05)；一点红提取物组大鼠尿液中UPro、UAlb、UOP与厄贝沙坦组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但尿液中Ucr显著高于厄贝沙坦组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠24 h饮食量、饮水量、尿量比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.4 各组大鼠血液中BUN、Scr、UA、Alb、TG、SBP比较 与正常对照组比较，模型组、厄贝沙坦组、一点红提取物组大鼠血液中BUN、UA、TG及血压均显著升高(P<0.05)，仅模型组的Scr较正常对照组显著升高(P<0.05)，厄贝沙坦组、一点红提取物组的Scr与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，厄贝沙坦组、一点红提取物组大鼠血液中BUN、Scr、UA、TG及SBP均显著降低(P<0.05)；与厄贝沙坦组比较，一点红提取物组仅TG显著降低(P<0.05)，其他指标差异无统计学意义(P>0.05)；四组间Alb比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3.5 各组大鼠体重和肾脏肥大指数比较 模型组、厄贝沙坦组、一点红提取物组大鼠的体重显著低于正常对照组(P<0.05)，而肾重、KI显著高于正常对照组(P<0.05)；与模型组比较，厄贝沙坦组和一点红提取物组大鼠的体重显著升高(P<0.05)，肾重、KI显著降低(P<0.05)；一点红提取物组大鼠的体重、肾重和肾脏肥大指数与厄贝沙坦组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

3.6 各组大鼠肾脏组织形态学观察 通过HE、PAS染色发现，正常对照组大鼠的肾脏组织中肾小球血管清晰，形态规则，内皮细胞和系膜细胞数目正常，无其他明显病变；与正常对照组相比，模型组有明显病变发生，肾间质有炎性细胞浸润，血管充血扩张，肾小球肥大，其内皮细胞肿胀、系膜细胞增生，肾小管排列紊乱；经厄贝沙坦和一点红提取物干预后，与模型组相比，两组的肾脏病变明显改善，肾间质尚有散在的炎性细胞浸润，内皮细胞尚有些许肿胀，系膜细胞增生已恢复正常，肾小管上皮形态正常，二者观察无明显差异。见图1、图2。

3.7 各组大鼠肾组织中TGF-β1和BMP-7免疫组化检测分析 由图3和表5显示，正常对照组大鼠肾组织中TGF-β1有少量表达，而模型组大鼠肾组织中TGF-β1的表达显著增多(P<0.05)，经过厄贝沙坦和一点红提取物分别干预后，与模型组相比较，厄贝沙坦组和一点红提取物组大鼠肾组织中TGF-β1的表达显著减少(P<0.05)，其中厄贝沙坦组大鼠肾组织中TGF-β1的表达略少于一点红提取物组，但两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠尿液中UPro、UAlb、Ucr及尿液渗透压比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与厄贝沙坦组比较，△P<0.05

表3 各组大鼠血液中BUN、Scr、UA、Alb、TG、SBP比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与厄贝沙坦组比较，△P<0.05

表4 各组大鼠体重、肾重、肾脏肥大指数比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

图1 各组大鼠肾脏的病理变化(HE，400×)

图2 各组大鼠肾脏的病理变化(PAS染色，400×)

图3 各组大鼠肾组织中TGF-β1表达(400×)

由图4和表5显示，正常对照组大鼠肾组织中BMP-7大量表达，而模型组大鼠肾组织中BMP-7的表达显著减少(P<0.05)，经过厄贝沙坦和一点红提取物分别干预后，与模型组相比较，厄贝沙坦组和一点红提取物组大鼠肾组织中BMP-7的表达显著增多(P<0.05)，两者BMP-7的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图4 各组大鼠肾组织中BMP-7表达(400×)

表5 各组大鼠肾组织中TGF-β1、BMP-7表达

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

糖尿病肾病为糖尿病所特有的并发症，其病理改变主要为肾小球硬化、肾小球基底膜增厚以及系膜基质的过度累积[9-11]。随着糖尿病病程的进展，肾脏的病变程度逐渐加重，大量累积的系膜基质以及增厚的基底膜会挤压、闭塞毛细血管，从而导致肾脏纤维化，乃至最终肾衰竭的发生，因此，对于如何延缓糖尿病肾病的进程以及探索有效的防治手段具有十分重大的意义。

有研究报道，TGF-β1是肾脏纤维化发生的核心因子，能够促进肾脏细胞肥大、胞外基质的积聚，从而导致肾脏纤维化[12]。BMP-7是TGF-β超家族的蛋白之一，可拮抗TGF-β1的作用，并能够抑制细胞外基质的形成和肾小管上皮细胞的分化，从而起到抗肾脏纤维化的作用[13]。由此可见，TGF-β1和BMP-7在肾脏纤维化的过程中有互逆的作用。正常情况下，抑制纤维化作用和促纤维化作用会形成一种动态平衡，而当出现病理改变时，这种平衡便会被打破，从而导致肾脏纤维化的发生。

厄贝沙坦是一种强效的血管紧张素Ⅱ受体抑制剂，研究表明，其能够减少糖尿病肾病的尿蛋白、内质网应激，保护肾功能，对于延缓糖尿病肾病的发展进程安全有效[14-17]，故本实验选择其作为阳性对照药物，研究一点红对糖尿病大鼠的一般状况、尿液和血液的生化指标、肾脏病理变化以及肾组织中TGF-β1和BMP-7的表达，以探讨一点红对糖尿病的肾保护以及延缓肾病进程的可能机制。

通过研究发现，模型组大鼠的24 h饮食量、饮水量、尿量、UPro、UAlb、Ucr、UOP、BUN、Scr、UA、TG、肾重、KI及TGF-β1和BMP-7的表达与正常对照组比较差异均有统计学意义，病理明显改变，表明糖尿病大鼠的肾功能已经严重减退。与模型组相比较，厄贝沙坦组与一点红提取物组大鼠的24 h饮食量、饮水量、尿量均显著降低，表明糖尿病的“三多”症状明显改善；尿液中的UPro、UAlb、Ucr等指标和血液中的SUN、Scr、UA、TG等指标降低，以及尿液渗透压UOP升高，均表明一点红对糖尿病大鼠的肾脏具有明显的保护作用；肾重、KI的显著降低也表明了一点红能够显著减轻糖尿病大鼠的肾脏肥大；同时，免疫组化后TGF-β1表达的显著降低和BMP-7表达的显著升高，表明一点红能够下调糖尿病肾组织中TGF-β1的表达水平，提高BMP-7的表达水平；且通过肾脏病理形态学的观察，更直接客观地反映了一点红对糖尿病大鼠肾脏的改善作用。

此结果提示，一点红对糖尿病大鼠的肾脏具有一定的保护作用，其机制可能为降低肾脏中TGF-β1的表达，同时增加BMP-7的表达，使糖尿病肾组织中TGF-β1和BMP-7的表达达到平衡状态，从而起到对肾脏的保护作用。其具体机制还有待进一步研究，以便为降糖新药的开发及后续临床合理用药奠定基础。