肺癌细胞中CD59 rs79077373遗传变异对其转录活性的影响*

郭锦翠，张艳艳，杨振邦，牛泽人，张雪梅

（1.华北理工大学公共卫生学院，河北 唐山 063000；2.华北理工大学生命科学学院，河北 唐山 063000）

肿瘤是全人类面临的一个巨大公共卫生问题，肺 癌在所有恶性肿瘤死因中居首位[1]。肿瘤发生的主要原因之一是肿瘤对补体监视的免疫逃避[2]。膜结合性补体调节蛋白（membrane-bound complement regulatory proteins, mCRPs）在机体内能够与补体相互作用，动态调节补体的激活与抑制，在保护自身组织的同时还能有效杀灭外来有害成分[3]。CD59作为mCRPs中重要成分之一，与炎症、创伤及某些肿瘤等疾病有密切的关系[4-5]。研究表明，CD59在乳腺癌[5-6]、结肠癌[7]、肺癌组织[8]中显现出高表达。

基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）是人群中普遍存在的核苷酸改变，而启动子区的多态性影响基因的转录水平，进一步导致蛋白表达水平的改变，导致肿瘤和疾病的发生和发展[9]。本研究旨在探讨CD59启动子区遗传变异对基因转录的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

质粒pGL3-Basic、pRL-SV40以及双荧光素酶报告基因检测、凝胶回收、质粒提取试剂盒购自美国Promega公司，LipofectamineTM2000试剂购自美国Invitrogen公司，限制性内切酶KpnⅠ、NheⅠ和连接酶T4 DNA分别购自美国New England Biolabs和日本TaKaRa公司。A549、NCI-H2030、NCI-H23非小细胞肺癌细胞株购自美国菌种保藏中心。

1.2 实验方法

1.2.1 启动子区SNP筛选 对国际共享数据库Ensembl中基因CD59启动子区SNP信息进行数据挖掘，将CD59基因转录起始位点上游扩展1 500 bp，筛选出可影响基因转录因子结合位点的SNP位点，规定在中国人群中的最小等位基因频率不＞0.05，采用转录因子数据库（www.gene-regulation.com）中的软件TRANSFAC分析软件预测对转录因子结合有影响的SNP位点，最终共筛选出1个SNP位点（CD59 rs79077373）。

1.2.2 CD59启动子区报告基因载体构建与鉴定 使用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，CD59启动子区PCR扩增所用引物序列：正向5'-GGGGTACCCCTC AAGCAACGCAAACTAC-3'，反向5'-CTAGCTAGCTA GCCCCCGCATTCTTTCGCT-3'。该PCR产物长2 282 bp（-2 234 bp，+47 bp）引物两端分别加上酶切位点KpnⅠ、NheⅠ及对应的保护碱基。

调整PCR仪器反应程序，将反应体系离心6 s，立即放置到PCR仪，进行片段的扩增，一般在94℃的温度条件下预变性10 min，然后进入循环扩增阶段：第1阶段为94℃变性45 s，第2阶段为61.5℃退火45 s，第3阶段为72℃延伸2 min，这3个阶段进行35个循环，循环完成后进行10min的72℃延伸。将扩增片段切胶回收，使用KpnⅠ、NheⅠ进行双酶切后与pGL3-Basic报告基因载体进行连接。随后将连接后的产物进一步转化成肠杆菌DH5α，接着挑取其中的阳性单克隆，最后进行测序的确认，构建完成的质粒定点突变由苏州泓迅生物技术有限公司完成，根据测序结果将重组质粒分别标记为pGL3-rs79077373C和pGL3-rs79077373T。

1.2.3 细胞培养及重组质粒转染 转染前1天将状态良好的A549、NCI-H23和NCI-H2030以每孔2×105个细胞均匀接种到板中，当密度到70%后，根据使用说明书转染重组质粒。质粒转染情况为：800 ng的重组质粒（pGL3-rs79077373C或pGL3-rs79077373T）和10 ng的内参质粒pRL-SV40，每组转染质粒的细胞至少设置3个实验的复孔，每次以相同的条件相同的试剂至少重复3次实验。培养24 h后，对细胞进行裂解，然后收集细胞，测定荧光素酶活性。

1.2.4 双荧光素酶活性检测 根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒提供的说明书进行操作并设定发光检测仪，型号为Glo Max 20/20。600 μl PBS清洗，加100 μl PLB裂解液，室温下轻摇板15 min，将裂解液移至EP管中，瞬时离心后进行进一步检测。EP管中加入50 μl LAR Ⅱ和15 μl裂解产物，F值即Firefly荧光素酶活性应被即刻检测，随后50 μl 1×Stop &Glo溶液被立即加入到24孔板中，R 值即Renilla荧光素酶活性，计算荧光素酶活性即F值与R值之比。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析

应用转录因子数据库（www.gene-regulation.com）中的软件TRANSFAC分析预测CD59 rs79077373 C/T遗传变异对潜在的转录因子结合位点影响（见图1）。无转录因子结合的情况是当该位点为C等位基因时；当该位点出现T等位基因，此时存在转录因子TBP与之结合。因此采用双荧光素酶报告基因实验验证预测结果，探讨生物学意义。

图1 生物信息学预测rs79077373 C/T对转录因子结合位点的影响

2.2 CD59基因启动子区重组质粒结果验证

CD59重组质粒经测序验证后rs79077373位点为C等位基因，将其命名为pGL3-rs79077373C，利用构建好的重组质粒将rs79077373位点进行定点突变，突变后的重组质粒命名为pGL3-rs79077373T。重组质粒利用双酶切后经琼脂糖凝胶电泳进行验证，酶切片段与插入片段长度相符（见图2A）。重组质粒测序结果利用Blast与NCBI数据库中CD59基因启动子区序列进行比对，一致性为100%（见图2B）。

图2 CD59基因启动子区载体构建结果验证

2.3 荧光素酶报告基因活性检测

将 重 组 质 粒 pGL3-rs79077373C、pGL3-rs79077373T、空质粒pGL3-Basic分别与内参质粒pRLSV40共 转 染 于 NCI-H2030、NCI-H23、A549 3株非小细胞肺癌后，荧光素酶活性的表达情况检测见图3。重组质粒荧光素酶相对活性经对照组校正，每组质粒转染细胞至少设置3个复孔，数据由3次独立重复实验得出，用（±s）表示每组数值。A549细胞中，pGL3-rs79077373T组的荧光素酶相对活性值为（17.95±0.50），pGL3-rs79077373C组的荧光素酶相对活性值为（8.99±0.56），经t检验，差异有统计学意义（t=-20.639，P=0.000），pGL3-rs79077373T组的荧光素酶相对活性值为pGL3-rs79077373C组的2.00倍。NCI-H23细胞中，pGL3-rs79077373T组的荧光素酶相对活性值为（18.89±1.13），pGL3-rs79077373C组的荧光素酶相对活性值为（10.36±0.44），经t检验，差异有统计学意义（t=-12.150，P=0.000），pGL3-rs79077373T 组的荧光素酶相对活性值为pGL3-rs79077373C组的1.82倍。NCIH2030细胞中，pGL3-rs79077373T组的荧光素酶相对活性值为（6.17±0.71），pGL3-rs79077373C组的荧光素酶相对活性值为（4.36±0.43），经t检验，差异有统计学意义（t=-3.752，P=0.020），pGL3-rs79077373T组的荧光素酶相对活性值为pGL3-rs79077373C组的1.42倍。

图3 CD59基因rs79077373报告基因荧光素酶相对活性

3 讨论

CD59又称保护素，位于人类11号染色体长臂，其糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定到细胞膜表面。CD59蛋白的功能突出表现在以下几个方面：①CD59通过与C8和（或）C9结合、干扰C9插入细胞膜内或C9的多聚化，进而阻断补体攻膜复合物（MAC）的装配，保护宿主细胞免于受补体的溶破[10]。②CD59可以作为第二信号刺激物，一方面可以诱导T淋巴细胞的激活，另外参与免疫反应的调节过程[11]。③CD59作为CD2的配体能够与CD2相结合形成CD59-CD2复合物，随后激活T细胞并且诱导T细胞及其他组织细胞的黏附，并进一步调节组织细胞的生长[12]。

CD59在肿瘤细胞中的高表达可能有助于肿瘤逃避免疫监视和补体介导的细胞溶解。CD59在结直肠癌中表达上调，与结直肠癌的临床分化和病理分期明显相关，并且CD59沉默的结肠癌细胞会增强对化疗药物的敏感性[7，13]。在乳腺癌研究中，CD59表达明显增加并且CD59的缺失可导致肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的CD59基因表达后，Fas和Caspase-3的表达上调Bcl-2的表达降低，从而诱发肿瘤细胞的凋亡和生长抑制[14]。在CD59与肺癌关系的研究中[8，15]，通过体内和体外实验都发现CD59在肿瘤细胞中的表达要高于正常肺组织细胞，补体系统对肿瘤细胞介导的裂解作用被抑制，CD59的高表达可能是肿瘤细胞逃避补体攻击和抵制单克隆抗体治疗肺癌的重要原因，提示CD59是肿瘤发生及恶性进展的主要因素之一。

本研究证实，CD59启动子区SNP rs79077373 T等位基因可增加CD59的启动子区转录活性，说明CD59启动子区遗传变异可以在转录水平上调控其表达，为深入研究CD59基因在肿瘤中高表达的分子机制奠定了基础。