染料木素对HT29细胞IL-8分泌及Akt/NF-κB活化的影响*

徐成飞，韦立群，李通，潘晓航，甘嘉亮

（广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021）

染料木素又称染料木黄酮，分布于豆科植物中的一种天然异黄酮类药物[1]，具有多种生物活性，多种体内外试验中有明确的抗炎活性[2-3]，但在炎症肠病（inflammatory bowel disease, IBD）中的作用目前尚未见报道。研究表明结肠上皮细胞与肠道免疫功能之间“crosstalk”在炎症肠病中有着重要意义[4]，同时在IBD中肠上皮细胞与肠道中免疫细胞可能起到类似的作用[5-6]。所以本研究利用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和人干扰素γ（human interferon-gamma, hIFN-γ）诱导HT29细胞产生炎症模型，探讨染料木素是否具有抑制炎症的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人结肠腺癌细胞系HT29购自上海细胞生物研究所，染料木素购自上海源叶生物科技有限公司，达尔伯克改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle medium, DMEM）购自中国维森特生物技术有限公司，噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）购自美国Sigma公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自澳大利亚Excellbio公司，RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，RNA逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNase H Plus） 购 自 日 本 TaKaRa公司，酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒购自武汉华美生物科技有限公司，p-Akt（S473）、Akt、p-p65、p65 及 GAPDH 兔抗人多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞分组及处理

A组为对照组：加入完全培养基培养；B组为模型组：给予IFN-γ20 ng/ml孵育12 h，再加入1 μg/ml LPS孵育4 h；C-E组为观察组：在模型组的基础上给予不同浓度的染料木素（25、50及100 μmol/L）孵育24 h。

1.3 HT29细胞培养

HT29细胞采用DMEM培养基培养（10%的胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）于37℃的5% 二氧化碳CO2孵育箱中培养。采用对数生长期的细胞进行实验。

1.4 细胞增殖观察

采用的MTT方法。取对数生长期的HT29细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，以4×103个/孔接种到96孔板中。待细胞贴壁后并分加入染料木素（0、25、50、100及200 μmol/L），每个浓度设置3个复孔。放置于5% CO2、37℃的细胞培养箱中孵育24 h后加入MTT溶液，继续培养4 h，弃上清液后，每孔加入二甲基亚砜150 μl避光在微量震荡器上震荡15 min，490 nm的酶标仪测定其吸光值，计算细胞增殖率。重复3次试验。

1.5 白细胞介素的检测

采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real time-polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测白细胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6, IL-6）、白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）、白细胞介素10（interleukin-10, IL-10）的表达量。取对数生长的细胞接种于培养瓶中，按1.2分组及方法收集细胞。依照美国Invitrogen公司RNA试剂提取盒进行RNA提取，定量后按照逆转录TaKaRa试剂盒说明书进行逆转录，用逆转录的cDNA为模版进行扩增，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，序列见表1。反应条件：50℃孵育2 min，95℃活化10 min 1个循环，95℃变性15 s，60℃退火1 min，共40个循环。基因相对表达量使用2-△△Ct进行分析。重复3次实验。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 检测细胞上清液中IL-8的含量

用ELISA试剂盒进行测定。收集1.2的分组方法培养的细胞液上清液，在4℃低温离心机以2 000 r/min速度，离心5 min，收集上清液，置入-80℃冰箱冷冻保存备用。检测时按华美ELISA试剂盒说明书进行细胞上清中的IL-8含量的检测。实验重复3次。

1.7 Western blot检测 p-Akt（S473）、Akt、p-p65、p65蛋白表达

收集1.2的分组方法培养的细胞，用RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF）、Cocktail提取各组细胞总蛋白量，使用核酸检测仪检测样品蛋白浓度。用10%分离胶60 V恒压电泳，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜进行半干转，5%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）封闭1 h。分别加入稀释为1∶1 000的p-Akt（S473）、Akt、p-p65、p65 及 GAPDH 抗体 4℃摇床过夜，在室温避光孵育荧光二抗2 h，浓度为（1∶10 000），使用双色红外荧光扫描成像系统进行扫膜。用Image J进行蛋白灰度值的分析处理，目的蛋白比上内参GAPDH作为蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染料木素对HT29增殖的影响

不同浓度染料木素作用HT29细胞24 h细胞的增殖率分别为：100%、（99.34±2.67）%、（99.46±3.80）%、（98.42±0.70）%和（94.36±2.28）%，经单因素方差分析，差异无统计学意义（F=2.869，P=0.080）。200 μmol/L以下浓度的染料木素对HT29的增殖几乎无影响。后续研究采用25、50及100 μmol/L作为药物实验浓度。

2.2 各组HT29细胞中炎症因子mRNA的表达量

5组IL-1β、IL-6及IL-10的mRNA相对表达量经单因素方差分析，差异无统计学意义（F=1.486、1.650及1.433，P=0.278、0.237及0.293）。5组IL-8的mRNA相对表达量经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=172.048，P=0.000）；模型组较对照组表达IL-8高（P＜0.05），观察组IL-8表达较模型组低（P＜0.05）。见表 2。

2.3 各组HT29细胞上清液中IL-8的含量

各组上清液IL-8含量分别为（112.66±7.23）、（1 420.69±76.74）、（1 258.66±93.07）、（845.77±117.06）及（446.95±72.73）pg/ml，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=133.204，P=0.000）。模型组比对照组上清液表达IL-8高（P＜0.05），观察组上清液IL-8表达量较模型组低（P＜0.05）。

表2 IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10的mRNA相对表达量情况 （±s）

表2 IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10的mRNA相对表达量情况 （±s）

注：A：对照组；B：模型组；C-E分别为模型组加入不同染料木素浓度的观察组（25、50及100 μmol/L）。1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 IL-1β IL-6 IL-8 IL-10 A 1 1 1 1 B 1.08±0.14 1.04±0.03 219.72±18.691） 1.04±0.04 C 1.09±0.11 1.01±0.01 121.21±18.582） 1.05±0.03 D 1.03±0.21 1.03±0.02 28.89±3.202） 1.05±0.04 E 1.33±0.31 1.04±0.04 23.54±2.802） 1.04±0.02 F值 1.486 1.650 172.048 1.433 P值 0.278 0.237 0.000 0.293

2.4 染料木素对HT29细胞炎症模型Akt/NF-κB（p65）通路蛋白表达的影响

各组p-Akt（S473）和p-p65蛋白相对表达量经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=100.430、76.321，均P=0.000），模型组 p-Akt（S473）和 p-p65蛋白相对表达量较对照组高（P＜0.05），观察组p-Akt（S473）和p-p65蛋白相对表达量比模型组低（P＜0.05）。各组Akt和p65的蛋白相对表达量经单因素方差分析，差异无统计学意义（F=0.463和1.361，P=0.762和0.314）。见附图和表3。

表3 染料木素对Akt/NF-κB（p65）通路蛋白表达的影响 （n =3，±s）

表3 染料木素对Akt/NF-κB（p65）通路蛋白表达的影响 （n =3，±s）

注：A：对照组；B：模型组；C～E分别为模型组加入不同染料木素浓度的观察组（25，50及100 μmol/L）。1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 p-Akt Akt p-p65 P65 A 0.234±0.024 0.814±0.003 0.293±0.071 0.841±0.008 B 0.828±0.0191） 0.816±0.008 0.858±0.0421） 0.848±0.003 C 0.750±0.0432） 0.812±0.003 0.753±0.0162） 0.847±0.005 D 0.632±0.0292） 0.815±0.004 0.618±0.0422） 0.847±0.001 E 0.491±0.1002） 0.818±0.008 0.448±0.0372） 0.849±0.003 F值 100.430 0.463 76.321 1.361 P值 0.000 0.762 0.000 0.314

附图 染料木素对Akt/NF-κB（p65）蛋白表达水平的影响

3 讨论

IBD是累及胃肠道的慢性非特异性炎症，主要包括溃疡性结肠炎、克罗恩病[6]，西方发达国家是该病的主要发生区域，仅在北美地区约有150万的患者[1]，但在过去的10年，亚洲患病人数增加1倍[7]，提示该病在世界范围内逐渐扩展。目前，IBD的发病机制及病因仍不明确，可能与免疫、精神、遗传等有关，药物控制是其主要的治疗方法，包括氨基水杨酸、免疫抑制剂、糖皮质激素等药物[8]，其目的是缓解症状，改善患者的生活质量[9]。传统这类药物治疗会引一系列严重的副作用，如骨髓抑制、肝肾功能损害等[10]。因此，有必要寻找副作用少新的替代药物。

染料木素于1899年从染料花中分离出来，广泛分布在豆科植物中，具有抗肿瘤、抗氧化等药理作用[1]。近年来发现它具有抗炎作用。EO等[2]发现，喂食染料木素可以降低用四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠的延迟损伤修复过程中的炎症反应，并可以减轻炎症因子的释放。王小倩等[3]在体外试验中发现染料木素可以促进AMPKα磷酸化抑制LPS诱导的RAW264.7表达肿瘤坏死因子（tumor necrosis factors, TNF-α）、IL-6。炎症肠病的慢性炎症可能是由于促炎因子异常持续分泌而导致[11]，而IL-8是主要的趋化因子之一。IL-8可以激活中性粒细胞，诱导其表达多种促炎因子，如：IL-6、TNF-α、IL-1β[11-12]。本研究结果显示，IL-8 mRNA表达升高，而IL-1β、IL-6、IL-10无变化。ELISA检测培养上清液中IL-8蛋白表达也升高，提示细胞炎症模型是成功的。在此基础上，后续给予不同浓度的染料木素处理，结果显示染料木素能抑制IL-8 mRNA表达和细胞上清中IL-8蛋白表达，提示染料木素可能具有一定的抗炎活性。

LPS是革兰阴性杆菌细胞壁组成部分，在许多实验中可用来诱导产生炎症反应[13]。LPS能够特异性识别表达在巨噬细胞、上皮细胞细胞等表面的Toll样受 体 4（toll-like receptors 4, TLR4）[14]。TLR4识 别LPS后诱导髓样分化因子88（myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88）依赖性细胞内的信号传导过程，MyD88召集IL-1受体相关激酶（IL-1 receptor-associated kinases, IRAKs）、 肿 瘤 坏 死 因子受体相关因子6（tumor-necrosis factor receptorassociated factor 6, TRAF6），从而激活核因子κB激酶抑制剂（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK）复合体，IKK磷酸化后介导NF-κB激活，处在包质中的NF-κB被激活后转入细胞内发挥生物学活性，使IL-8、IL-1β、TNF-α基因转录增强而高表达[15]，持续大量的NF-κB激活与炎症程度呈正相关。所以NF-κB活性是炎症程度的一个重要指标。Akt是NF-κB上游激活的信号激活，他们在调节肿瘤细胞增殖、血管生成、转移中起重要的作用[16]，活化的Akt也能激活NF-κB进入细胞核，促使相关炎症因子的基因转录表达增强[17]。本研究免疫印记实验结果显示，随着浓度的增大，染料木素逐渐抑制p-Akt（S473）/p-p65的活性，提示染料木素对Akt/NF-κB通路具有抑制作用。

综上所述，染料木素能抑制LPS和hIFN-γ诱导HT29细胞的炎症反应，其机制可能与抑制Akt/NF-κB通路有关。为深入研究染料木素抗炎作用提供一定的理论基础。