泛素化羧基末端水解酶37在结直肠癌组织中的表达水平及意义

邓显伦，冯立波，徐建伟，向继勇，夏冬

（1.西南医科大学附属医院 普外科，四川 泸州 646000；2.四川省中江县人民医院 普外科，四川 中江 618100）

2012年的数据显示全球新发结直肠癌病例数约为140万[1]，为导致肿瘤相关性死亡最主要的原因之一[2]。因此，更深入的寻找与结直肠癌进展相关的分子及潜在机制显得有尤为迫切。泛素化羧基末端水解酶37（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 37, UCH37）是去泛素化酶家族成员，其可通过从蛋白泛素连接链的远端亚基水解聚泛素而抑制蛋白降解[3]。研究显示UCH37在多种肿瘤组织中表达上调，并促进肿瘤的进展[4-5]。本研究拟检测结直肠癌标本中UCH37的表达情况，并分析其临床相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2010年6月-2012年12月于西南医科大学附属医院普外科接受结直肠癌根治术，术后病理显示所切除的肿瘤组织为结肠癌或直肠癌患者的肿瘤组织及癌旁组织标本77例。组织标本收取后分为两部分，一部分冻于液氮中供后续提取RNA用，一部分进行石蜡包埋供免疫组织化学检测用。入组患者在术后3个月后开始随访记录，随访截止时间点为患者死亡或至2016年7月本研究截止日。入组患者详细临床病理资料见表1。所有入选本次研究的结直肠癌患者术前未进行包括放疗、化疗及靶向治疗，术中所取肿瘤组织及相应的癌旁组织，经液氮冻存或石蜡包埋长期储存。本研究已经西南医科大学附属医院伦理委员会审核并批准，所有入组患者均亲自签署知情同意书，授权课题组使用其组织标本进行本项科学研究。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学（简称免疫组化） 二甲苯脱蜡2次，100%～70%梯度酒精脱水。柠檬酸盐缓冲液高压修复90 s。30 ml/L过氧化氢孵育20 min，磷酸盐缓冲液清洗5 min×5次。兔抗人UCH37单克隆抗体（ab131244）（1∶100）4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液清洗5 min×5次。加入聚合物增强剂，37℃孵育20 min，磷酸盐缓冲液清洗5 min×5次。加入酶标抗兔聚合物放大剂，37℃孵育15 min，磷酸盐缓冲液清洗5 min×5次。DAB显色，苏木素复燃，1 ml/L盐酸酒精分化，磷酸盐缓冲液返蓝，脱水，透明，封片。染色结果判定每个片子随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，统计阳性细胞百分率及着色程度。免疫组化染色结果由两位病理科医师以双盲的方式完成，两者不一致的结果请上级病理医师与两人经多镜头显微镜下讨论得出一致结果。阳性细胞百分率＜25%或不着色及较淡着色者为阴性，阳性细胞百分率＞25%或适中着色及深着色者为阳性。

1.2.2 RNA提取及逆转录 RNA提取采用Trizol法，Trizol够自于美国Sigma公司，将液氮冷冻过的组织研磨成粉末状，加入1 ml Trizol继续研磨至裂解呈透明状。12 000 r/min 4℃离心5 min，上清转移至一新离心管中。加入裂解液1/5体积的氯仿，用力振荡至充分乳化。12 000 r/min 4℃离心15 min。吸取上清液至一新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒15次，静置10 min。12 000 r/min 4℃离心15 min。弃去上清，加入75%的乙醇1 ml，12 000 r/min 4℃离心5 min。所得沉淀加入20 μl去离子水，即为所需RNA。逆转录采用10 μl体系，RNA定量后，取1 μl RNA，加入5× Prime Script RT master（日本 TaKaRa 公司）2 μl，7 μl去离子水。轻柔混匀后，进行逆转录反应。反应条件为：37℃ 15 min RNA二级结构打开，逆转录酶工作；85℃ 5 s形成CDNA，置入4℃冰箱储存。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR） 采用TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqⅡ试剂盒进行qRT-PCR，配置PCR反应液，PCR反应采用25 μl体系，组分如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5 μl，UCH37或β-actin正向链引物1 μl，UCH37或βactin反向链引物1 μl，实时定量产物2 μl，去离子水8.5 μl。PCR反应条件为：95℃预变性30 s；95℃扩增15 s，60℃ 延伸30 s，共40个循环。反应结束后样品置入4℃冰箱保存。UCH37引物序列：正向5'-TGTC TCATGGAAAGCGACCC-3'，反向 5'-GCCACTTGAAAA GAAAAATTAACCC-3'；β-actin引物序列：正向5'-CG TCTTCCCCTCCATCGT-3'，反向 5'-GAAGGTGTGGTGC CAGATTT-3'。计算公式为：UCH37相对表达量：

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验；相关分析用Spearman法，绘制K-M生存曲线，比较用Log-rank χ2检验；影响因素的分析采用Cox风险比例模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCH37 mRNA在结直肠癌及癌旁组织中的表达水平

qRT-PCR结果显示，结直肠癌组织中UCH37 mRNA表达水平为（5.138±1.266），癌旁组织UCH37 mRNA的表达水平为（1.325±0.519）。两者UCH37 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（t=2.746，P=0.043），UCH37 mRNA在结直肠癌组织中的表达水平高于癌旁组织。

2.2 UCH37蛋白在结直肠癌中的表达水平

UCH37的阳性表达率在TNM Ⅰ和Ⅱ期患者为40.625%（13/32），TNM Ⅲ和Ⅳ期为 68.889%（31/45）。两者间UCH37阳性率差异有统计学意义（χ2=6.104，P=0.019），UCH37蛋白在TNM Ⅲ和Ⅳ期结直肠癌患者组织中的阳性率高于TNMⅠ和Ⅱ期结直肠癌患者。见图1。

2.3 UCH37的表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系

图1 UCH37蛋白在结直肠癌组织中的表达 （×40，×200）

表1 UCH37与结肠癌患者临床病理特征的相关性

UCH37的表达水平与结直肠癌患者血管侵袭情况（rs=5.729，P=0.019）和淋巴结转移情况呈正相关（rs=4.364，P=0.04），而与其他病理特征无相关性。见表1。

2.4 UCH37的表达与结直肠癌患者术后5年总生存率的关系

根据UCH37免疫组化结果，将结直肠癌患者分为UCH37阳性组和UCH37阴性组。Kaplan-Meier生存曲线显示，UCH37阳性组与阴性组结肠癌患者术后五年总体生存率差异有统计学意义（χ2=3.979，P=0.049），UCH37阳性组的结直肠癌患者术后5年总体生存率低于UCH37阴性组，见图2。

2.5 UCH37的表达水平与结直肠癌患者预后的关系

单因素分析结果显示，TNM分期、淋巴结转移情况、远处转移情况、血管侵袭及UCH37的表达水平与总体生存预期相关。多因素分析结果显示，TNM分期、淋巴结转移情况、远处转移情况、血管侵袭及UCH37表达水平均为判断结直肠癌患者预后的分子指标。见表2。

图2 UCH37的表达与结直肠癌患者术后5年总体生存率的关系

表2 结直肠癌患者生存时间影响因素的单因素及多因素分析Cox风险比例模型相关参数

3 讨论

蛋白底物可与泛素共价性结合，而后被蛋白酶体识别并降解为小分子肽。泛素-蛋白酶体系是真核生物细胞内蛋白降解的非溶酶体途径。去泛素化酶可水解底物蛋白上的泛素链之间的链接，从而抑制蛋白降解[6-8]。该蛋白降解调控机制参与多种的细胞生理过程，如转录调控、增殖、分化以及肿瘤发生[9-11]。UCH37是去泛素化酶家族成员，可去泛素化Ⅰ型活化型转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）受体，而使其免于被蛋白酶体降解，从而上调TGF-β依赖的基因表达[12-13]。此外，UCH37也可去泛素化Smad2和Smad3，增强其蛋白稳定性，从而间接活化TGF-β1信号通路[14]。更为重要的是，沉默UCH37的表达可活化Caspase-9和Caspase-3而有效地诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡[15]。既往研究发现，UCH37在卵巢癌中异常高表达，并可作为卵巢癌独立判断预后的分子指标[16]。此外，UCH37在肝细胞癌中表达上调，并可与葡萄糖调节蛋白78（glucoseregulated protein 78, GRP78）结合而调控细胞存活[5]。另有研究发现，UCH37可通过调控Tcf7DNA的结合而活化Wnt信号通路，从而促进肿瘤进展[17]。值得注意的是，研究发现UCH37的选择性去泛素化酶抑制剂WP1130可介导在肿瘤中激活的UCH37等去泛素化酶，从而导致抗凋亡蛋白的表达下调，促凋亡蛋白的表达上调[18]。本研究均提示UCH37可能通过促进某些原癌基因的表达而在肿瘤发生进展中发挥着重要的作用。本研究的结果进一步支持UCH37在肿瘤进展中的促癌作用，本研究发现UCH37在结直肠癌组织中的表达高于癌旁组织，与结直肠癌淋巴结转移及TNM分期密切相关。生存分析结果也显示UCH37高表达的结直肠癌患者术后五年总体生存率低于低表达患者。Cox风险比例模型结果进一步显示UCH37为判断结直肠癌预后的分子指标。提示UCH37在结直肠癌中可能作为癌基因发挥作用，促进肿瘤的转移与增值。