肿瘤标志物、PTTG、VEGFR-3及血流参数在宫颈病变中的价值*

吉洁，申兴斌，韩冰，张玉娟，马志君

（承德医学院附属医院 1.南院区病案室，2.病理科，3.妇科，4.神经外科，河北 承德 067000）

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌。其发病年龄趋向年轻化、病死率高，易发生转移，严重威胁女性生殖健康[1]。宫颈癌早期症状不典型，大部分就诊时已进展至中晚期，错失最佳治疗时机。一般认为，宫颈癌的发生及进展为持续性病变的过程（包括不典型增生-原位癌-早期清润癌-浸润癌）。自宫颈上皮内瘤样病变（cervicalint raepithelialneoplasia, CIN）发展至宫颈癌浸润癌时间约为6、7年[2]，早期检出CIN为防治宫颈病变进展为宫颈癌的关键途径。而肿瘤发病为多基因、多因素共同作用的过程（包括原癌基因激活、抑癌基因丧失活性及DNA修复基因缺陷等）。垂体瘤转化基因（pituitary tumor-transforming gene, PTTG）系自大鼠GH4垂体细胞内分离的原癌基因[3]，其在组织增殖、转化及肿瘤发生等过程中均有重要作用。且在子宫内膜、肾上腺及卵巢等肿瘤中均呈高表达状态，而在胸腺、睾丸以外正常组织中表达水平极低[4]。血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3）则为最早发现淋巴管特异性调控受体，主要表达与淋巴结管内皮及受损血管内皮中，同时也表达于血管内皮形成初期阶段、新生血管内皮及肿瘤细胞内，参与血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C, VEGF-C）信号转导及淋巴管内皮细胞增殖、分化等过程[5]。而微血管密度（microvascular density, MVD）及血流动力学指标则反映肿瘤新生血管生成及血流灌注的重要指标[6]，可作为评估宫颈病变进展的依据。基于此，为探讨肿瘤标志物、PTTG、VEGFR-3及血流动力学指标在宫颈良恶性病变中的表达及临床意义，现对该院收治的98例宫颈病变患者的临床资料进行回顾性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性研究2012年3月-2016年2月该院收治且经病理确诊的97例宫颈病变患者的临床资料。慢性宫颈炎患者20例。年龄23～54岁，平均（42.6±5.4）岁；均为患子宫脱垂、子宫腺肌瘤或子宫肌瘤在该院行子宫切除术者，无其他内科合并症，术后均经病理确诊为慢性宫颈炎。CIN 47例。年龄26～59岁，平均（44.3±6.2）岁，均为该院接受子宫切除术或宫颈锥切术病例，无内科合并症，术后经病理证实为CIN。其中CIN Ⅰ级20例，Ⅱ级13例，Ⅲ级14例。宫颈浸润癌患者30例。年龄27～63岁，平均（47.6±7.1）岁，均行子宫癌根治术或全子宫切除术，术前均未进行放化疗，术后经病理确诊，国际妇产科联盟宫颈癌分期（FIGO）Ⅰ期10例，Ⅱ期13例，Ⅲ期7例；分化程度：高中分化20例，低分化11例，有淋巴结转移17例；所有病例均有石蜡标本及外周血标本存档；入院后均完成超声检查，有明确血流动力学检查资料；无其他部位原发恶性肿瘤；既往无宫颈手术史；且病例资料完整。

1.2 主要试剂及仪器

兔抗人PTTG多克隆抗体、兔抗人VEGFR-3多克隆抗体、鼠抗人D2-40单克隆抗体（购自北京中杉金桥生物技术有限公司），免疫组织化学Max Vision试剂盒、DAB显色试剂盒（购自福州迈新生物技术开发有限公司），西门子Compact-XP全自动电化学发光仪及配套试剂盒（购自德国西门子公司），立鹤电热恒温箱（山东潍坊医疗器械厂），低温冰箱（青岛海尔电器股份有限公司），BX40F4显微镜及照相系统（日本Olympus公司），自动脱水机、旋转式切片机（英国Shandon Thrmo公司），彩色多普勒超声诊断仪（美国GE公司）。

1.3 方法

①肿瘤标志物水平测定：取血液标本，离心后分离血清备用，采用全自动电化学发光及配套试剂盒、校准液及质控品，应用电化学发光法测定所有患者血清血清鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma, SCC）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9, CA199）、糖类抗原125（carbohydrate antigen 125,CA125） 水 平。 ② PTTG、VEGFR-3、MVD测 定：采用免疫组织化学法，取病理蜡块，常规切片，厚度5 μm，电热恒温箱高温（80℃）烘烤50 min，常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline,PBS）冲洗3次，每次5 min，滴入3%过氧化氢清除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS冲洗3次×5 min，加热至沸腾，热抗原修复，室温冷却，PBS冲洗3次，每次5 min，加正常山羊血清，37℃孵育0.5 h，滴加一抗（兔抗人PTTG多克隆抗体、兔抗人VEGFR-3多克隆抗、鼠抗人D2-40单克隆单体）50 μl于载玻片，4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5 min，加入生物素标记二抗（酶标羊抗鼠/兔免疫球蛋白G复合物），室温孵育0.5 h，PBS冲洗3次，每次5 min，DAB显色5 min后终止，蒸馏水冲洗，苏木素复染，二甲苯透明，封片，镜下观察。③血流动力学测定：所有患者（非月经期）术前1周均采用Logiq S6型彩色多普勒超声诊断仪（美国GE公司）检查血流动力学，常规探查腹部后取截石位，探头套避孕套，涂耦合剂，缓慢置入阴道内，观察内部血流状况，连续监测3个稳定周期，记录收缩期峰值血流速度（peak systolic velocity, PSV）、舒张末期血流速度（end diastolic velocity, EDV）及血管阻力指数（resitance index, RI）。

1.4 免疫组织化学结果判定

PTTG、VEGFR阳性表达定位于细胞浆内，呈棕黄色，选取5个高倍视野，观察其阳性表达情况，以阳性细胞所占比例及染色强度进行评分。阳性细胞所占比例为1分：＜25%；2分：25%～50%；3分：＞50%。染色轻度：0分为不着色；1分：浅棕黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色。染色结果（阳性细胞所占比例评分×染色强度评分）：阴性（-）为0分；弱阳性（+）：1、2分；中度阳性（++）：3、4分；强阳性（+++）：＞4分。D2-40阳性表达定位于内皮细胞膜及胞浆、参照Weidner标准[7]，选取肿瘤微血管数量丰富区域作为观察区，重复选取5个视野，取均值。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，多组比较进行方差分析，组内行LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同类型宫颈病变患者肿瘤标志物水平比较

慢性宫颈炎、CIN及宫颈浸润癌患者SCC、CA199及CA125水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。慢性宫颈炎患者SCC、CA199及CA125水平均低于CIN与宫颈浸润癌患者（P＜0.05）；CIN患者SCC、CA199及CA125水平低于宫颈浸润癌患者（P＜0.05）。见表 1。

2.2 不同类型宫颈病变患者PTTG、VEGFR-3表达阳性情况比较

慢性宫颈炎、CIN及宫颈浸润癌患者PTTG、VEGFR-3表达阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。CIN、宫颈浸润癌患者PTTG、VEGFR-3表达阳性率高于慢性宫颈炎患者（P＜0.05）；宫颈浸润癌患者PTTG、VEGFR-3表达阳性率高于CIN患者（P＜0.05）。见表2和图1、2。

表1 不同类型宫颈病变患者肿瘤标志物水平比较（±s）

表1 不同类型宫颈病变患者肿瘤标志物水平比较（±s）

注：1）与慢性宫颈炎比较，P ＜0.05；2）与CIN比较，P ＜0.05

组别 SCC/（ng/ml） CA199/（u/ml） CA125/（u/ml）慢性宫颈炎组（n =20） 1.15±0.14 10.11±3.79 13.06±5.14 CIN组（n =47） 3.21±1.441） 15.22±5.261） 20.89±7.881）宫颈浸润癌组（n =30） 11.08±3.171）2） 48.39±10.271）2） 46.51±11.021）2）F值 23.987 32.935 24.785 P值 0.000 0.000 0.000

表2 不同类型宫颈病变患者PTTG、VEGFR-3表达阳性情况比较

图1 不同类型宫颈病变患者PTTG表达 （SP×200）

图2 不同类型宫颈病变患者VEGFR-3表达 （SP×200）

2.3 不同类型宫颈病变患者MVD、PSV、EDV及RI指标比较

慢性宫颈炎、CIN及宫颈浸润癌患者MVD、PSV、EDV及RI比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。慢性宫颈炎患者MVD低于CIN、宫颈浸润癌患者（P＜0.05），CIN患者MVD低于宫颈浸润癌患者（P＜0.05）。CIN、宫颈浸润癌患者PSV、EDV均高于慢性宫颈炎患者（P＜0.05），而 RI低于慢性宫颈炎患者（P＜0.05）；宫颈浸润癌患者PSV、EDV高于CIN患者，而RI低于CIN 患者（P＜0.05）。见表 3。

表3 不同类型宫颈病变患者MVD、血流动力学指标的比较 （±s）

表3 不同类型宫颈病变患者MVD、血流动力学指标的比较 （±s）

注：1）与慢性宫颈炎比较，P ＜0.05；2）与CIN比较，P ＜0.05

组别 MVD PSV/（cm/s） EDV/（cm/s） RI慢性宫颈炎组（n =20） 7.11±1.67 30.26±7.14 6.82±1.22 1.56±0.44 CIN组（n =47） 10.27±1.561） 38.71±7.691） 10.26±2.761） 1.15±0.121）宫颈浸润癌组（n =30） 16.33±2.171）2） 52.64±10.261）2） 16.52±2.891）2） 0.67±0.361）2）F值 39.544 16.878 28.842 16.784 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

宫颈癌是女性常见生殖道恶性肿瘤，近年来发病趋向年轻化[8]。人乳头状瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染是引起宫颈癌发病的主要原因，此外性生活提前、不良性行为等均与宫颈癌发病有关[9]。随分子生物学技术的发展，癌基因在宫颈癌发生及进展中的作用日益引起临床研究者的关注[10]。PTTG系在大鼠垂体肿瘤中克隆出的新型促肿瘤生长及转移原癌基因，定位于5号染色体长臂，与多类肿瘤复发有关[11]。PTTG基因包括5个外显子与4个内含子，编码200余个氨基酸，其转录起点位于第一外显子区，存在多个可与转录因子共同作用的核苷酸序列，包含不同反应元件序列及结合位点，而转录因子则可与上述位点共同作用，调节PTTG在不同组织表达情况。研究发现，人体正常卵巢、肝脏、大脑及肾脏等组织，无PTTG表达或表达水平极低，而在胸腺、睾丸等组织则呈高表达[12]。DANG等[13]对子宫内膜癌患者病理组织PTTG表达情况进行检测发现，其表达水平高于增生子宫内膜组织及正常子宫内膜组织。张红平等[14]对晚期卵巢癌患者进行癌基因筛查发现，卵巢癌PTTG呈高表达。但对宫颈病变患者PTTG表达情况尚少见报道。本研究选取慢性宫颈炎、CIN及宫颈浸润癌患者分别检测患者宫颈组织PTTG表达，结果发现，慢性宫颈炎患者未见PTTG阳性表达，而宫颈浸润癌患者PTTG表达阳性率高于CIN，推测PTTG在宫颈癌发病早期即存在异常表达，在患者出现CIN时，PTTG表达增多，大量激活，过度表达促成宫颈癌发病。分析其机制则主要与PTTG可促进c-myc基因转录，影响染色体正常分离，导致异倍体产生，增加组织突变风险，促进肿瘤表型转化有关。其次，PTTG蛋白含碱性区与酸性区，其中酸性区可募集多个细胞内信号分子，传递生长刺激信号至细胞核，激活多类肿瘤基因表达，促进细胞变性。

VEGFR-3则为VEGF-C同源受体，又称作fms样络氨酸激酶4，多表达于正常组织、胚胎组织淋巴管内皮细胞内，系特异性淋巴管内皮细胞标志物，在传递内皮细胞有丝分裂信号中起关键作用[15]。陈晓露等[16]发现，VEFR-C与VEGFR-3 两者结合可导致受体络氨酸磷酸化，激活促分裂原活性蛋白激酶通路，引起淋巴管内皮细胞增殖，促进淋巴管生成。有学者进行动物试验发现，小鼠体内接种VEGF-C细胞株可促进肿瘤淋巴管生成[17]。李龙等[18]研究指出，胃癌、肺癌等易发生淋巴结转移的实体瘤患者VEGFR-3通常呈高表达，且表达水平与肿瘤浸润程度、淋巴结转移及患者预后存在密切关联。本研究对宫颈病变患者病变组织VEGFR-3表达情况进行检测发现，宫颈浸润癌患者VEGFR-3表达阳性率高于CIN及慢性宫颈炎患者，推测VEGFR-3表达上升，可能增加脉管通透性，促进内皮细胞增殖、转移，提升癌细胞对淋巴管的趋化作用，促进癌细胞播散，导致癌细胞转移至淋巴管。宫颈浸润癌患者MVD及肿瘤标志物水平SCC、CA199及CA125均高于CIN及慢性宫颈炎，且其血流动力学指标PSV、EDV均快于CIN、慢性宫颈炎，RI低于CIN、慢性宫颈炎，提示宫颈浸润癌患者肿瘤标志物水平上调幅度高，MVD上升，新生血管生成增多，同时肿瘤组织血流速度加快，局部血流丰富，且肿瘤新生血管管壁薄，血管网紊乱，管腔不规则扩张，引起动静脉瘘、血管湖形成，导致血流阻力降低。而慢性宫颈炎及CIN患者血管通透性低，血流阻力高，恶性程度低，提示肿瘤血管生成在宫颈组织癌变过程中有其重要作用。

综上所述，宫颈浸润癌患者癌组织PTTG、VEGFR-3阳性表达率高，且肿瘤标志物水平呈高表达，MVD上升、肿瘤新生血管生成多、血流速度快，与宫颈良性病变有差异。推测PTTG、VEGFR-3均可引起宫颈细胞表型改变，促进癌细胞淋巴结转移及新生血管形成，在宫颈癌发病中有其重要的协同效应。