系统性红斑狼疮患者抗TPO及抗c-mpl抗体与血小板减少的相关性分析

王维娟，方 璇，厉小梅，汪国生，陶金辉，王 钢，李向培

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种弥漫性自身免疫性结缔组织病，临床上可累及全身多个系统，血液系统损害较为常见，其中血小板减少是SLE患者常见临床表现之一。具有明显出血倾向的血小板减少症在SLE患者中并不常见，但是严重者出现脑出血或消化道出血可危及生命。顽固性血小板减少症目前仍是临床治疗中的一大难题，是SLE患者预后不良的独立危险因素[1]。探讨SLE血小板减少的致病机制，寻找其有效治疗方法尤为重要，目前研究主要集中在多种自身抗体，包括抗血小板抗体、抗血小板生成素(thrombopoietin，TPO)抗体、抗血小板生成素受体(c-mpl)抗体等[2]。TPO是骨髓巨核细胞分化、成熟和释放血小板的主要细胞因子，通过与靶细胞膜表面特异性受体c-mpl结合发挥其生理作用。但目前未见同时研究TPO、抗TPO抗体及抗c-mpl抗体及其相关性的报道。该研究旨在探讨抗TPO抗体及抗c-mpl抗体与SLE患者血小板减少之间的相关性。

1 材料与方法

1.1研究对象选取安徽医科大学附属省立医院风湿科门诊或住院的SLE患者共62例,均符合1997年美国风湿病协会制定的SLE诊断标准。其中伴血小板减少SLE患者36例(血小板<100×109/L，A组)，血小板计数4×109/L～98×109/L，平均(58.4±25.5)×109/L；无血小板减少SLE患者26例(B组)，血小板计数101×109/L～370×109/L，平均(184.0±73.6)×109/L。A组36例，男5例，女31例，年龄20～64岁，平均(35.75±10.87)岁，病程1周～240月，平均(53.85±62.29)月。B组26例，男2例，女24例，年龄15～63岁，平均(35.88±11.68)岁，病程1～276月，平均(60.65±74.07)月。健康对照组11例(C组)，男3例，女8例，年龄21～42岁，平均(30.55±7.16)岁，血小板计数正常且无风湿性疾病及血液系统疾病等。三组间性别、年龄匹配，差异无统计学意义(F=2.496,P=0.269；F=1.125,P=0.330)。A、B两组间病程差异无统计学意义(t=0.392，P=0.697)。所有纳入的研究对象符合伦理学标准并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1收集SLE患者的临床资料 包括年龄、病程、临床表现等情况，采用系统性红斑狼疮活动指数(systemic lupus erythematosus disease index，SLEDAI)评估SLE的疾病活动度。

1.2.2检测指标 包括血常规、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate， ESR)、C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、补体C3、C4、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)、抗双链DNA抗体(anti-dsDNA)等。

1.2.3血清抗TPO抗体、血清抗c-mpl抗体及血清TPO水平检测 采集静脉血5 ml，2 000 r/min离心5 min，上清液置于EP管中，-80 ℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清TPO水平，按照试剂盒说明书要求进行操作。采用间接ELISA法检测血清抗TPO抗体及抗c-mpl抗体。具体如下:分别用重组人TPO及c-mpl(美国R&D System公司)以4 mg/L浓度包被ELISA微孔板(美国R&D System公司)，4 ℃过夜，洗涤6次后加入0.05 g/L小牛血清蛋白(美国R&D System公司)封闭非特异性位点，37 ℃温育1 h，洗涤后每孔位加入100 μl待测血清，洗涤后加入酶标抗体工作液(上海科新生物技术股份有限公司)，洗涤后每孔加入TMB使用液(美国R&D System公司)100 μl，37 ℃温育20 min后加入稀硫酸终止反应，最后用酶标仪450 nm波长下测定吸光度值。阳性判断标准：吸光度值大于或等于C组平均值2.1倍及以上。分析其与临床表现、实验指标及SLEDAI之间的关系

2 结果

2.1血清TPO水平血清TPO水平在A、B 两组及健康对照组中分别为(220.30±173.45)ng/L、(149.05±94.49)ng/L和(74.86±25.90)ng/L，三组间差异有统计学意义(F=5.495，P=0.006)，A组明显高于C组(t=2.751,P=0.009)。

2.2血清抗TPO抗体水平

2.2.1血清抗TPO抗体检出率 SLE患者中抗TPO抗体总阳性率41.9%(26/62)，在A组、B组和C组的阳性率分别为55.6%(20/36)、23.1%(6/26)和0(0/11)，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，抗TPO抗体在A、B两组间差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2.2血清抗TPO抗体与SLE患者临床表现和实验指标的关系 抗TPO抗体阳性者易出现皮疹(P<0.05)；抗体阴性者易出现抗核小体抗体(P<0.05)；抗体阴性组较抗体阳性组APTT、PT均延长，差异有统计学意义(P<0.05)，但两组APTT、PT数值均在正常范围内；抗TPO抗体阳性组和阴性组间血小板计数、血清补体C3及C4、ESR、CRP、抗dsDNA阳性率、抗β2-GP1及SLEDAI评分差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1、2。

2.3血清抗c-mpl抗体

2.3.1血清抗c-mpl抗体检出率 SLE患者中抗c-mpl抗体总阳性率为25.8%(16/62)，抗c-mpl抗体在SLE伴血小板减少组、SLE血小板正常组和健康对照组的阳性率分别为25%(9/36)、26.9%(7/26)和0，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，抗c-mpl抗体阳性率在A、B两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3.2血清抗c-mpl抗体与SLE患者临床表现和实验指标的关系 抗c-mpl抗体阳性者易出现皮疹(P<0.05)；抗c-mpl抗体阳性组和阴性组间血小板计数、血清TPO、血清补体 C3及 C4、ESR、CRP、抗dsDNA阳性率、抗β2-GP1、APTT、PT及SLEDAI 评分差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3、4。

2.4SLE患者不同血小板计数间抗TPO抗体、抗c-mpl抗体阳性率比较将SLE血小板减少患者分为三组：Ⅰ组(10例)，血小板<50×109/L；Ⅱ组(16例)，50×109≤血小板<70×109/L；Ⅲ组(10例)，70×109≤血小板<100×109/L，组间比较抗TPO抗体、抗c-mpl抗体差异均无统计学意义(P<0.05)；三组分别与B组比较，Ⅲ组抗TPO抗体阳性率明显升高，差异有统计学意义(P=0.005)，余两组抗TPO抗体阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；三组抗c-mpl抗体分别与B组比，阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5血清TPO、抗TPO抗体、抗c-mpl抗体相关性

2.5.1SLE患者血清TPO、抗TPO抗体、抗c-mpl抗体相关性 SLE患者抗TPO抗体阳性率与抗c-mpl抗体呈正相关(r=0.320，P=0.011)；抗TPO抗体、抗c-mpl抗体均与血清TPO水平无明显相关性(r=0.054，P=0.677；r=0.035，P=0.787)。

表1 抗TPO抗体阴性组与阳性组临床表现的比较[n(%)]

表2 抗TPO抗体阴性组与阳性组实验室指标的比较

表3 抗c-mpl抗体阴性组与阳性组临床表现的比较[n(%)]

表4 抗c-mpl抗体阴性组与阳性组实验室指标的比较

2.5.2SLE伴血小板减少患者血清TPO、抗TPO抗体、抗c-mpl抗体相关性 SLE血小板减少患者抗TPO抗体阳性率与抗c-mpl抗体呈正相关(r=0.387，P=0.020)；抗TPO抗体、抗c-mpl抗体均与血清TPO水平无明显相关性(r=-0.016，P=0.926；r=0.083，P=0.629)。

3 讨论

SLE是一种可累及全身多个系统的慢性自身免疫性炎性疾病，血小板减少是SLE患者较为常见的血液系统受损表现，发生率为7%～40%，其中重度难治性血小板减少不足5%[3]。其发病机制尚不明确。TPO是骨髓巨核细胞发育成熟和血小板生成的主要生理性调节因子，其受体c-mpl主要表达在血小板、巨核细胞及CD34+细胞膜上。TPO通过与靶细胞膜上特异性高亲和力c-mpl受体结合激活JAK和STAT等信号通路，以诱导巨核细胞分化成熟和促进血小板生成[4]。目前血清TPO水平体内调控机制尚不明确, 多认为主要受巨核细胞数和血小板数及其膜表面c-mpl受体调控，当巨核细胞或血小板数增多时，TPO与c-mpl相结合导致循环血液中TPO含量降低；而当巨核细胞或血小板数减少时，TPO含量升高。多数研究[5-7]显示，SLE患者体内血清TPO水平较健康对照者明显升高，而SLE伴血小板减少者更甚。另有研究[8]显示，SLE患者体内TPO水平升高与其合并血小板减少症和血栓症无关，而与白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)和巨噬细胞炎症蛋白-1α等炎性介质相关。

2000年，Vadhan-Raj et al[9]报道发现了抗TPO 抗体的存在。2002年，Füreder et al[5]采用酶联免疫分析法(EIA)在SLE患者血清中检测到该抗体，并发现SLE血小板减少组较SLE血小板正常组抗TPO抗体检出率高；在血小板减少SLE患者中，抗TPO抗体阳性者血小板下降更明显，推测可能抗TPO抗体与SLE患者血小板减少相关。2006年，Ziakas et al[6]改良了Füreder的方法，在SLE患者中再次检测到抗TPO抗体，其检出率为36.8%(7/19)，并发现该抗体在体外可以抑制巨核细胞的增殖。本研究显示，SLE患者中抗TPO抗体总的阳性率为41.9%，与既往文献报道相近。A组较B组抗TPO抗体阳性率升高(P<0.05)，抗TPO抗体阳性者较阴性者血小板计数明显减少，提示抗TPO抗体与SLE血小板减少有一定相关性。本研究显示抗TPO抗体阳性组与阴性组血清TPO水平差异无统计学意义，提示该抗体引起血小板减少不仅仅是中和TPO导致骨髓巨核细胞发育分化受到抑制，可能有更多更复杂的机制参与血小板减少。

Kuwana et al[10]报道了SLE患者抗c-mpl 抗体的存在，发现11.6%(8/69)SLE患者及8.3%(7/84)ITP患者检测出该抗体，而健康者未被检出。Kuwana et al[2]再次报道了1例合并血小板减少的系统性硬化症患者血清抗c-mpl抗体阳性，而抗磷脂抗体、抗血小板抗体及抗TPO抗体均阴性，提示血小板减少与该抗体相关。本研究提示，SLE患者抗c-mpl抗体总的阳性率为25.8%，A、B 两组患者中抗c-mpl抗体的阳性率差异无统计学意义，而健康者体内未检出，与杨拓 等[7]报道一致。杨拓等[7]发现抗c-mpl抗体阳性组SLE患者血小板计数明显低于阴性组，而血清TPO水平明显高于阴性组,推测抗c-mpl抗体可能通过与TPO竞争结合c-mpl阻断了TPO/c-mpl通路，使巨核细胞分化、成熟障碍，从而引起血小板减少。而本研究得出两组间血小板计数和血清TPO水平差异虽然无统计学意义，但血清TPO水平阳性组高于阴性组。提示抗c-mpl抗体可能与SLE伴血小板减少相关，可能与本研究样本量较小、检测方法等多方面因素影响有关，需要一个更大样本量、多种检测方法、多中心研究来进一步验证。

目前抗TPO抗体及抗c-mpl抗体作用机制尚不完全清楚。罗雄燕 等[11]通过对176例SLE患者骨髓像分析，发现与SLE血小板正常患者相比,SLE血小板减少患者幼稚巨核细胞明显增多，而巨核细胞总数和产板型巨核细胞均明显减少，提示SLE血小板减少与巨核细胞增殖分化障碍相关。多数研究[12]显示抗TPO 抗体阳性者TPO水平下降明显，该抗体可能通过中和TPO抑制巨核细胞增殖、成熟。TPO通过与巨核细胞膜表面特异性受体c-mpl结合促进巨核细胞成熟和生成血小板。而抗c-mpl抗体与c-mpl结合可抑制巨核细胞发育成熟，从而导致血小板生成减少[13]。抗c-mpl 抗体阳性患者血清TPO水平升高，可能与该抗体与TPO竞争结合c-mpl阻断了TPO/c-mpl通路，使巨核细胞发育、成熟障碍，从而引起血小板减少[7]。抗TPO抗体及抗c-mpl抗体也可能通过抗原抗体间免疫反应消耗了血小板或者通过杀伤骨髓巨核细胞影响血小板生成。具体机制还有待深入研究。

本研究进一步分析了抗TPO抗体、抗c-mpl抗体与除血小板减少外的其他临床表现和实验室指标的关系，结果显示抗TPO抗体、抗c-mpl抗体阳性者均易出现皮疹，提示出现皮疹的SLE患者容易出现抗TPO抗体和抗c-mpl抗体。抗TPO抗体、抗c-mpl抗体阳性组与阴性组血清补体 C3及 C4、ESR、CRP、抗dsDNA阳性率、抗β2-GP1及SLEDAI 评分差异均无统计学意义。另外本研究显示SLE患者中抗TPO抗体与抗c-mpl抗体具有相关性，提示SLE患者两抗体中任何一抗体阳性均易出现另一抗体阳性，两抗体之间可能具有相互交叉的致病机制，具体机制有待进一步研究。

本研究对SLE伴血小板减少患者抗TPO抗体及抗c-mpl抗体作用做了初步探讨，但其具体机制较复杂，需要通过扩大样本量、多种检测技术等进一步深入研究。TPO、TPO受体(c-mpl)及其抗体能否用于临床病情预测、治疗评估还需要进行大规模的研究证实，TPO受体激动剂及针对c-mpl及抗c-mpl抗体的生物制剂能否成为SLE血小板减少患者治疗的新方向新靶点还有待进一步研究。