尿液miRNA143和miRNA133a在膀胱癌诊断中的应用

陆 阳，梁 伟，宋永胜

（1.本溪市中心医院泌尿外科，辽宁 本溪 117000；2.中国医科大学附属盛京医院泌尿外科，辽宁 沈阳 110004）

膀胱癌是泌尿系统高发肿瘤，死亡率居泌尿系统肿瘤的第2位。膀胱癌诊断的金标准是膀胱镜检查及组织病理活检。早期诊断及治疗可以提高膀胱癌患者的存活率，改善患者生活质量。膀胱镜检查为有创性检查，疼痛、血尿等并发症导致其临床应用受限。目前，已有研究证明微小RNA（microRNA，miRNA）在肿瘤患者中表达异常[1-2]。泌尿系统肿瘤与miRNA关系的研究已表明其参与肿瘤的进展[3-4]。因此，本研究拟探讨尿液miRNA143和miRNA133a相对表达量在膀胱癌诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年1月—2016年12月本溪市中心医院膀胱癌患者（膀胱癌组）50例，其中男28例、女22例，年龄36～78岁，所有患者均行经尿道膀胱肿瘤电切手术或膀胱全切手术，术后病理确诊为膀胱癌。采用1974年国际抗癌联盟（the International Union Against Cancer，UICC）年会标准[4]对50例膀胱癌患者进行TNM分期，其中T1期25例、T2期20例和T3期5例。膀胱癌患者术前未行放化疗，术前检查无其他系统肿瘤。选取同期本溪市中心医院泌尿系非肿瘤疾病患者（疾病对照组）50例，其中男24例、女26例，年龄39～80岁，包括尿路感染15例、尿路结石15例、前列腺增生症20例。选取同期本溪市中心医院体检健康者50名作为正常对照组，其中男25名、女25名，年龄35～75岁。3组之间年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究获本溪市中心医院医学伦理学会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 收集膀胱癌组术前及术后3个月、疾病对照组、正常对照组晨尿50 mL。尿液标本收集后30 min内4℃ 3 000×g离心10 min，分离尿沉渣和上清。尿上清移至Eppendorf 管内，按照mirVana PARIS试剂盒（美国Invitrogen公司）说明书要求提取RNA，利用紫外分光光度计测定总RNA浓度。A260nm/A280nm比值的范围为1.88～2.00。提取物使用前置-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 逆转录与聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 使用逆转录试剂盒（美国promega公司）对提取的RNA逆转录成cDNA。反应条件：37 ℃ 60 min；65 ℃ 5 s。PCR反应体系： 5 μL cDNA，5 μL SYBR green MIX（日本Takara公司），靶基因上、下游引物各1 μL，去RNA水3 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s；共40个循环。检测仪器为Prism 7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。PCR引物由大连宝生物工程有限公司合成，U6 F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAT-3'；U6 R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；miRNA143 F：5'-TAGCATGAGGCGTTAGCATTTC-3'；miRNA143 R：5'-TCACTGCAACCTCCTCCTCC-3'；miRNA133a F：5'-TCATATTTGGTCCCCTTCAACC-3'；miRNA133a R：5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC-3'。

对每个检测目标设定相同的循环阈值（cycle threshold，Ct）基线和截点。每份标本设置3个复孔。以内参U6为miRNA相对定量参照。计算每个标本所有Ct值的均值作为实际标本的Ct值，减去U6 Ct值的均值为ΔCt，计算相对表达量（2－ΔΔCt）来比较组间变化倍数[4]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据呈非正态分布，用中位数（M）[四分位数（P25～P75）]，组间比较采用Mann-Whitney U检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价尿液miRNA143和miRNA133a诊断膀胱癌的价值。

2 结果

2.1 膀胱癌组、疾病对照组及正常对照组miRNA143、miRNA133a相对表达量的比较

膀胱癌组术前尿液miRNA143和miRNA133a的相对表达量均明显低于疾病对照组及正常对照组（P＜0.05），而疾病对照组与正常对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。膀胱癌组术后尿液miRNA143和miRNA133a的相对表达量明显高于术前（P＜0.05），与疾病对照组及正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 膀胱癌组术前、术后及疾病对照组、正常对照组尿液miRNA143、miRNA133a相对表达量的比较[M（P25～P75）]

2.2 膀胱癌患者不同TNM分期之间尿液miRNA143及miRNA133a相对表达量的比较

膀胱癌患者不同TNM分期之间尿液miRNA143及miRNA133a的相对表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 膀胱癌患者不同TNM分期之间尿液miRNA143、miRNA133a相对表达量的比较 [M（P25～P75）]

2.3 尿液miRNA143和miRNA133a诊断膀胱癌的价值

ROC曲线分析显示，术前尿液miRNA143相对表达量诊断膀胱癌的最佳临界值为 ≤0.165，曲线下面积（area under curve，AUC）为0.827，敏感性为72.7%、特异性为80.8%。术前尿液miRNA133a相对表达量诊断膀胱癌的最佳临界值为≤0.165，AUC为0.846，敏感性为75.0%、特异性为85.4%；二者联合检测的诊断性能无显著提高。见表3、图1。

表3 尿液miRNA143和miRNA133a诊断膀胱癌的ROC曲线参数

图1 尿液miRNA143及miRNA133a诊断膀胱癌的ROC曲线

3 讨论

膀胱癌的诊断依赖于膀胱镜检查与组织病理检查的结合。然而，膀胱镜检查是有创性检查，且价格较贵，给患者带来一定的经济和心理负担。膀胱癌的肿瘤标志物目前有多种，如膀胱肿瘤抗原、纤维连接蛋白等，这些指标均具有一定的敏感性和特异性，但都无法替代膀胱镜检查。尿液沉渣细胞RNA主要来源于肿瘤细胞、坏死或凋亡细胞、非细胞源等，易受到其他疾病的影响；尿液上清RNA则来源于细胞表面挤出的囊泡和循环中的miRNA，成分比较稳定，受其他干扰因素影响小[5-6]。WANG等[7]、SNOWDON等[8]通过对尿液上清及尿液沉渣DNA的比较发现，尿液上清DNA的敏感性和特异性更高。由于尿液miRNA稳定性较好，标本也易获得，因此可作为新的泌尿系统肿瘤的检测指标[9]。

miRNA143可以直接作用于肿瘤基因，从而影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和复发，在前列腺、肺、胃肠道系统等肿瘤中均发现其表达量明显下调[5]。miRNA133a在膀胱癌、乳腺癌、头颈部鳞癌、胃肠道恶性肿瘤中均发现其表达量明显下调，故可看作是一种抑癌基因。miRNA133a通过调节靶基因CD47和EGFR等来抑制肿瘤细胞的增殖、浸润[6]。本研究结果显示，膀胱癌患者术前尿液miRNA143和miRNA133a相对表达量均明显低于疾病对照组和正常对照组（P＜0.05）；肿瘤切除术后尿液miRNA143和miRNA133a的相对表达量均明显升高；膀胱癌患者尿液miRNA143及miRNA133a的相对表达量与肿瘤TNM分期无关。ROC曲线分析显示，术前尿液miRNA143、miRNA133a相对表达量诊断膀胱癌的最佳临界值均为≤0.165，敏感性分别为72.7%、75.0%，特异性分别为80.8%、85.4%。

综上所述，尿液miRNA143及miRNA133a的相对表达量可作为膀胱癌诊断和监测的辅助指标。由于本研究的样本量较少，因此要将尿液miRNA143及miRNA133a作为膀胱癌辅助诊断和疗效评价的无创性指标仍需加大样本量进一步验证。