上海地区儿童快速免疫层析法cTnI参考区间的建立

郑建新， 杨 慧， 傅启华

（上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，上海 200127）

急性心肌损伤的早期诊断是降低儿童病死率的关键。目前，临床诊断心肌损伤的实验室检测指标有肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）及肌钙蛋白等[1-2]。肌钙蛋白是横纹肌收缩的重要调节蛋白[3]，由3个亚基组成。心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）具有高度的心肌特异性，可用于检测微小的心肌损伤。cTnI在外周血中出现较早且持续时间较长，因此可作为心肌损伤检测敏感性和特异性最强的标志物之一，目前主要用于快速诊断急性心肌梗死、监测心脏手术及其预后[4]。儿童心肌损伤常见于窒息缺氧、先天性心脏病、心脏移植、病毒和细菌感染、川崎病、心脏外科手术、使用心脏毒性药物、冠状动脉发育异常、新生儿心肌梗死、代谢性心肌病等，且心肌损伤后病情进展迅速。目前，cTnI检测试剂生产厂商提供的参考区间为该方法的功能灵敏度（临界值），且多以成人为对象，尚缺乏儿童的参考区间，而儿童因其自身的生理特点与成人有异，因此建立上海地区儿童外周血cTnI参考区间显得尤为迫切。为此，本研究采用快速免疫层析法检测健康儿童末梢血cTnI，初步建立该方法的儿童末梢血cTnI参考区间。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年11月1日—2017年4月31日上海儿童医学中心儿保科完成调查问卷并符合筛选标准的7个月～12岁体检健康儿童240名，其中男108名、女132名。所有入选儿童血、尿常规及肝、肾功能均正常。调查问卷内容主要包括研究对象的发育及营养状况、有无心肾肝肺等重要脏器疾病、有无近期服药史，不涉及儿童姓名。同时查阅研究对象的门诊病历卡，保证调查问卷内容属实。排除发热、有心脏疾病史、有严重呼吸道疾病史以及近6个月有感染史、使用过药物的儿童。

1.2 仪器与试剂

锐普200荧光免疫分析仪（加拿大Response Biomedical公司）及配套试剂（快速免疫层析法）、质控品（RAMP cardiac control，批号241013）。Dade Dimension RxL全自动化学发光仪（德国西门子公司）及配套试剂（化学发光法）。

1.3 样本采集及测定

采集所有儿童手指末梢血后保存于乙二胺四乙酸抗凝管中，室温保存，2 h内完成检测。当日测定样本前测定1次质控品。严格按仪器及试剂说明书进行操作。

1.4 方法学评估

在检测cTnI前先对锐普200荧光免疫分析仪及配套试剂组成的检测系统进行方法学评估，以确定本方法是否能用于儿童末梢血cTnI检测。

1.4.1 准确性 将高值质控品（4.69 ng/mL）和低值质控品（0.47 ng/mL）作为样本进行检测，每个水平重复检测10次，计算均值（）。高、低值质控品测定值应在质控品标示的预期范围（低值为0.38～0.57 ng/mL，高值为3.75～5.63 ng/mL）内。

1.4.2 精密度 （1）日内精密度：将高、低值质控品作为样本平行测定10次，计算x 、标准差（s）和变异系数（coefficient of variation，CV）；（2）日间精密度：将高、低值质控品作为样本平行测定5次，连续检测5 d，计算、s和CV。

1.4.3 最低检测限 将低值质控品用生理盐水稀释16倍，至最低检测限0.03 ng/mL附近，然后进行检测，重复测定20次，计算和s，以+2s作为最低检测限，其结果应＜0.03 ng/mL。

1.4.4 线性范围验证 将厂商提供的线性质控品用专用稀释液稀释到原来浓度的3/5，得到可读范围的高值（26.40 ng/mL），记为点1；另取质控品稀释到原来浓度的1/2（22.00 ng/mL），记为点2。对点2的浓度进行倍比稀释，分别记为点3（11.00 ng/mL）、点4（5.50 ng/mL）、点5（1.10 ng/mL）、点6（0.55 ng/mL）、点7（0.028 ng/mL）。每一个浓度样本均重复检测3次，计算。用最小二乘法计算实测值与预期值的r值。

1.4.5 方法比对 将本方法与化学发光法进行比对并溯源。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。按Dixon法剔除离群值，如果D/R＞1/3，那该值便作为离群值被剔除，其中R为极差（当前所有值中最大值和最小值之差）、D为可疑值与下一个最值之间差值的绝对值。以百分位数法确定参考区间。

2 结果

2.1 离群值检验

Dixon法结果显示无离群值，因此保留所有测定数据。

2.2 方法学评价

2.2.1 准确度 高、低值质控品的检测结果分别为4.73和0.49 ng/mL，均在质控品说明书标示的预期范围内。

2.2.2 精密度 低值质控品日间和日内精密度（CV）分别为5.97%和6.35%，高值质控品日间和日内精密度（CV）分别为5.36%和7.14%，均符合厂家声明的要求（CV＜10%）。见表1。

表1 精密度验证结果

2.2.3 最低检测限 低值质控品稀释16倍后的检测结果为0.02 ng/mL，符合厂家声明的要求（最低检测限＜0.03 ng/mL）。

2.2.4 线性范围验证 在0.028～26.400 ng/mL范围内实测值与预期值呈正相关（r=0.998 3），线性方程为Y=0.997 4X+0.377 6（r2=0.996 6），符合厂商声明的线性范围要求。见图1。

图1 线性范围验证结果

2.2.5 方法学比对 相关性分析显示快速免疫层析法（Y）与化学发光法（X）的相关性良好，回归方程为Y=0.456X+0.011（r=0.988）。快速免疫层析法检测cTnI的第99百位数值为0.1 ng/mL，第99百位数值的不精密度为18.5%。见图2。

图2 快速免疫层析法与化学发光法的相关性

2.3 参考区间建立

将240名儿童的cTnI检测结果绘制直方图，见图3。从图3可以看出数据呈偏态分布，因此采用百分位数法进行分析。计算99%参考区间上限值，得出参考区间上限值为0.5 ng/mL。若根据厂家给出的参考区间（＜0.3 ng/mL）判断，240名体检健康儿童中有200名（83.3%）cTnI＜0.3 ng/mL，有40名（16.7%）cTnI＞0.3 ng/mL。将240名体检健康儿童按性别分别统计，其结果分布状态无明显变化。因此，根据99%参考区间上限值，同时结合试剂说明书中标示的参考区间（＜0.3 ng/mL），确定基于快速免疫层析法的儿童末梢血cTnI参考区间：＜0.3 ng/mL为阴性、＞0.5 ng/mL为阳性。对于cTnI为0.3～0.5 ng/mL的儿童，临床需结合其症状及体征进一步进行相关辅助检查，以判断其是否有心肌损伤。

3 讨论

中国合格评定国家认可委员会CL-02《医学实验室质量和能力认可准则》规定应定期评审生物参考区间。美国临床实验室标准化协会C28-A3文件强调确立一个可靠的参考区间时，可引用参考区间并进行验证，验证不通过时应建立适合本实验室的参考区间。

cTnI不仅具有较好的器官特异性，而且窗口期较长，是反映心肌损伤理想的标志物[5-6]。与CK-MB相比，cTnI的相对分子质量较小，心肌损伤后更容易被释放入血。cTnI 是心肌受到不可逆损伤时释放出的一种蛋白质，对心肌组织具有很高的特异性[7]。当心肌细胞膜受损时，游离于胞浆中的cTnI被释放到细胞外，使血清cTnI水平升高，其水平与心肌损伤面积的大小成正比。有研究结果显示，cTnI在急性心肌梗死发病12～72 h时的敏感性为100%，而72～150 h时仅为18%[9]。儿童的参考区间由于其自身的生理特点不同于成人，但试剂说明书中一般只提供18岁及以上健康成人的参考区间。近年来，各儿童医院临床实验室越来越重视根据检测系统建立适合自己实验室的参考区间。建立一个适合本实验室的cTnI参考区间是非常重要的，可以为心肌损伤患儿提供诊断、预后判断及疗效评价。本研究结果显示使用厂商提供的参考区间（＜0.3 ng/mL）进行判读，有16.7%（40/240）的儿童cTnI异常，然而这部分儿童血、尿常规及肝、肾功能指标均正常，心电图也无异常。由此可见，厂家说明书给出的参考区间（＜0.3 ng/mL）过低，不适用于上海地区儿童末梢血cTnI检测结果的判断。本研究通过分析240名健康儿童的cTnI检测结果，计算99%参考区间上限值为0.5 ng/mL。为避免临床对就诊儿童的误判，确定基于快速免疫层析法的儿童末梢血cTnI参考区间，即＜0.3 ng/mL为阴性、＞0.5 ng/mL为阳性。对于cTnI为0.3～0.5 ng/mL的儿童，临床需结合其症状、体征并进一步进行相关辅助检查，以判断其是否有心肌损伤。总之，本研究建立的参考区间有助于临床医生更好地结合患儿实际情况进行疾病的判断并指导治疗。