荣筋片对SAMP6鼠瘦素血清含量及骨组织蛋白表达的影响

李远栋，王 平，张君涛，杨 光，张雪竹

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300383）

骨质疏松症（Osteoporosis，OP） 是一种以骨量低下，骨微结构破坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病（世界卫生组织 WHO）[1-2]。对中老年人及绝经后女性身体健康有着严重威胁，且因骨质疏松导致的骨折发生率在逐年上升[3]，故骨质疏松症防治机制研究是众多学者的工作重点，而对于瘦素（Leptin）的研究就是重要的一方面，并且近些年在骨代谢方面研究已成为新的热点，可能为防治骨质疏松症提供新的研究思路[4-5]。本实验利用增龄性骨质疏松动物模型SAMP6鼠，观察院内制剂荣筋片对SAMP6鼠瘦素血清含量水平及骨组织蛋白表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 天津中医药大学第一附属医院院内制剂荣筋片主要组成为牛膝、白蒺藜、陈皮、杜仲、茯苓、甘草等（批号：津药制字（2001）Z 第 0195号）。羊抗兔二抗、B-ACTIN一抗（天津盛顺生物试剂销售有限公司），PVDF膜、BCA蛋白定量试剂盒（天津金博星生物科技有限公司）。Sigma 3C15K型高速冷冻离心机购自美国，分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司（型号：722），匀浆机购自德国（型号：Heidolph DIAX90），UV300核酸蛋白分析仪购自英国（型号：PYE-UNICAM／SPECTRONIC），细胞超声粉碎仪购自上海超声波仪器厂（型号：CPS-1）。选取6月龄SAMP6鼠30只，按体质量随机分为SAMP6荣筋片组、空白对照组，同源对照组选取同月龄SAMR1鼠15只。

1.2 方法

1.2.1 灌胃方法 为保证药物充分吸收，使小鼠空腹达6 nh以上。按人每kg体质量用药剂量计算，小鼠用药剂量与人用药剂量折算系数W＝9.01，故小鼠用药剂量（g/kg）计算公式应为：人常用剂量（g/kg）xW[6]。荣筋片组给予3 mL药液灌胃，空白对照组给予3 mL生理盐水灌胃，每天1次，连续12周。

1.2.2 制备血清 在最后一次灌胃1 h后将小鼠摘眼球采血，不予抗凝并待血块自然凝固收缩后1 500 rpm离心15 min，然后将分离出的上层血清保存在- 20 ℃下，用于酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定血清中瘦素（Leptin）的含量水平。

1.2.3 制备骨髓涂片 充分暴露小鼠股骨后将其剪断，利用镊子挤出或挑出骨髓，并将其放置于载玻片上，然后通过推玻片使骨髓液沿其边缘散开，在维持30°～45°角的情况下将推玻片平稳的推到载玻片另一边[7]，待涂片干燥后染色，每个标本制作一张图片。以便通过免疫组化测定骨组织中Leptin蛋白的表达水平。

1.2.4 统计方法 数据利用 SPSS 17.0 软件分析，计量资料以均数±标准差（x± s ）表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 血清Leptin含量水平的比较 荣筋片组、SAMRl对照组血清瘦素含量水平明显高于空白对照组（P＜0.05），有显著性差异；荣筋片组和SAMRl对照组组间没有显著性差异。见表1。

表1 各组血清Leptin含量（x± s ）

2.2 骨组织Leptin蛋白表达水平的比较 荣筋片组、SAMRl对照组骨组织瘦素蛋白表达水平明显高于空白对照组（P＜0.05），有显著性差异；荣筋片组和SAMRl对照组组间没有显著性差异。见表2。

表2 骨组织Leptin蛋白表达的平均光密度（x± s ）

3 讨论

“骨质疏松症”病名并没有在祖国医学记载，其临床表现及发病机理与中医学的“骨病”相似，故可以参考中医学的“骨痿”“骨痹”而辨证论治[8-9]。《素问·宣明五气篇》曰：“肾主骨”，《素问·阴阳应象大论》曰：“肾生骨髓”，《素问·六节藏象论》曰“肾其充在骨”[10-11]。故中医学认为骨病多源于肾虚，肾精虚则生化无源，骨失所养，则易骨断；肾精足则骨有所养，骨骼强健。所以中医治疗骨质疏松症多以补肾为主[12-13]。

院内制剂荣筋片是由我院骨伤科已故名老中医叶希贤主任所创立,具有补益肝肾，强健筋骨功效，在临床中已证实治疗骨质疏松症有较好的疗效[14]，药物组成中杜仲补益肝肾，强筋壮骨,沙苑子、续断补益肝肾，肝肾精气足，则筋骨强；熟地养阴补血，填精益髓，精足则髓足，髓足则骨强。四药共奏补益肝肾，强筋壮骨之功而为君药。山药滋养脾胃，平补三焦的作用，与茯苓、陈皮行气健脾而合为臣药，共奏运化脾胃之功。荣筋片中佐药则为丹参、当归、鸡血藤，起到养血活血通络之用。牛膝、蒺藜和甘草合为使药而共奏引经、调和诸药之效。全方肾气足，则精血足，精血足则髓足，髓足则骨健，共奏补益肝肾，强筋壮骨之效。

本实验结果表明，荣筋片能够提高血清瘦素含量和骨组织蛋白表达水平，可能会改善自发性骨质疏松动物骨髓基质干细胞成骨-成脂分化瘦素水平的异常。

SAMP6 鼠能够很好地体现增龄性骨质疏松症的病理机制，是研究骨质疏松症发病机制及制定有效防治方案的理想模型[15-16]。故近些年来多数学者利用此模型研究骨质疏松症发病机理。

众多学者注重运用补肾中药辨证论治对骨质疏松症整体调节，并显示出独特性，有望替代其他药物治疗骨质疏松症，其充分运用MSCs具有向脂肪细胞和成骨细胞方向分化的双向分化潜能特点[17-18]，以补肾为主的中药通过抑制MSCs向脂肪细胞分化、促进MSCs向成骨细胞分化及诱导脂肪细胞转化为成骨细胞[19-20]，肾精充足，则骨髓得以滋养，骨骼强健，故可以防治骨质疏松症。

瘦素受体是刺激腹内侧下丘脑降低骨髓脂肪细胞使细胞凋亡作用而降低骨髓脂肪[21-22]。本实验中小鼠的血清Leptin含量水平及骨组织Leptin蛋白表达水平均得到提高，但基于瘦素直接作用于MSCs或者间接作用中枢调节系统不同层次调节成骨-成脂分化机理[23-24]，荣筋片是中枢调节影响MSCs分化，还是直接作用MSCs促进向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化[25]，需更进一步研究。并且中医药对抗骨质疏松症的机制研究还存在局限性。所以，应运用现代科学技术对中医药进行更深入的研究，为中医药治疗骨质疏松症的机制提供充分的证据。