高效发酵人工窖泥的制备及应用研究

薛正楷 ，赵金松 ，张宿义 ，倪 斌 ，5

（1.泸州职业技术学院白酒学院，四川泸州 646001； 2.泸州市生物医学工程研究所，四川泸州646000；3.四川理工学院，四川自贡643000； 4.泸州老窖股份有限责任公司，四川泸州646002；5.泸州江潭窖酒业有限公司，四川泸州646005）

窖泥是浓香型白酒酿造的基础，其质量的优劣直接影响到所产基酒的质量。窖泥中微生物类群非常复杂，栖息着大量的己酸菌、乳酸菌、丁酸菌、甲烷菌、硫酸盐还原菌和硝酸盐还原菌等窖泥功能菌，对产生浓香型白酒的风格起着十分重要的作用[1]。窖泥质量不仅在于其理化指标丰富程度,更取决于这些有益窖泥功能菌的种类、数量及产物的代谢能力，以及营养成分的合理比例，是直接影响白酒质量的关键所在[2]。正是由于这些有益功能菌的大量生长、繁殖、代谢以及相互协调作用，才赋予了白酒的独特香型，造就了以已酸乙酯为主体香的浓香型白酒的典型风格[3]。因此，窖泥质量的优劣对浓香型白酒的质量起着至关重要的作用。但是传统人工窖泥在生产过程中有两个突出问题：新窖泥自然老熟时间太长；使用一段时间后窖泥会老化而影响酒的品质[4-5]。而在传统人工窖泥培养的基础上，通过采取加入协调而全面的优良菌种、科学合理的培养配方，增加窖泥中有益微生物菌群和各种营养成分，并加速其老熟，以缩短自然老熟时间[6-14]。

拟采用本研究选育的产己酸菌菌株L.fusiformis-ep-SigB，制备窖泥，为该菌株的产业应用提供理论和技术支持。

1 材料

1.1 窖泥制备材料

窖皮泥、老窖泥、豆饼粉、麸皮由泸州精圣酒庄惠赠；黄泥土、酒糟、黄水、底锅水、酒尾由泸州江潭窖酒业有限公司惠赠；中偏高温大曲粉，购自泸州怀玉制曲有限公司；酵母膏、碳酸氢钠（NaHCO3）、氟化钠（NaF）、硫酸钠（Na2SO4）、乙酸钠（CH3COONa）、EDTA二钠（C10H14N2O8Na2·2H2O）、酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）、氢氧化钠(NaOH)、碘化钾（KI）、氯化汞（HgCl2）、氢氧化钾（KOH）、酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）、钼酸铵（[(NH4)6Mo2O7·4H2O]）、氯化亚锡（SnCl2）、四苯硼钠[NaB(C6H5)4]、磷酸二氢钾（KH2PO4）、硫酸铵（[(NH4)2SO4]）、硝酸钾（KNO3）、硫酸钾（K2SO4）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、硫酸镁（MgSO4）、无水乙醇、无磷活性炭、阿拉伯胶粉、甘油、甲醛，购自成都科龙试剂厂；FastDNA®SPINKitforSoil购自MPBIO公司；L.fusiformis-ep-SigB己酸菌液由本实验室提供。

1.2 人工窖泥配方

根据文献和生产实践[15-19]，本项目配制下列8个窖泥方案进行筛选。

方案1（X1）：L.fusiformis-ep-SigB菌液2.5%；20%vol酒尾10%；黄泥土50%；窖底泥0.5%；优质大曲粉8%；香醅8%；磷酸氢二钾0.05%；乙酸钠1.5%；酵母膏0.54%；黄水8.45%；水10.46%。

方案2(X2)：黄黏土40%；泥碳5.04%；窖皮泥15%；L.fusiformis-ep-SigB菌液1.5%；大曲粉2.5%；豆饼粉1.5%；骨粉0.5%；母（底）糟或丢糟1%；黄浆水（按固体材料比）5%；尾酒（20%vol）15%；醋酸钠3%；磷酸氢二钾0.05%；水9.91%。

方案3(X3)：黄泥40%；粮糟3%；曲粉2%；L.fusiformis-ep-SigB菌液5%；黄水3%；豆饼粉1%；磷酸氢二钾0.02%；尾酒10%；泥碳5%；污泥2%；底锅水1%；窖皮泥4.57%；生香窖母4%；水19.41%。

方案4(X4)：黄黏土53%；母糟6.5%；黄水6.5%；中高温曲粉2.5%；窖皮泥7.89%；豆饼粉1%；L.fusiformis-ep-SigB菌液6.5%；30%vol低度酒1.3%；骨粉0.7%；水14.11%。

方案5(X5)：黄泥100%；老窖泥5%；窖皮泥10%；酒糟8%；大曲粉3%；豆饼粉1.5%；黄水8%；酒尾5%；营养盐0.11%；乙酸钠0.1%；L.fusiformis-ep-SigB菌液10%；底锅水适量。

方案6(X6)：黄泥100%；窖皮泥10%；酒糟5%；大曲粉2%；豆饼粉1.2%；麸皮3%；L.fusiformis-ep-SigB菌液10%；酒尾（12%vol）15%；黄水5%；乙酸钠0.05%；磷酸氢二钾0.01%；酵母膏0.01%；藕塘泥适量；底锅水适量。

方案7(X7)：以黄泥为100%标准计,黄水10%,酒糟10%，L.fusiformis-ep-SigB菌液10%,曲粉1.0%，豆饼1.5%，NaAc 0.1%，KH2PO40.16%，(NH4)2SO40.005%，MgSO40.002%，蛋白胨0.01%，酒精4%。

方案8(X8)：以黄泥100%为标准计，老窖泥3%；L.fusiformis-ep-SigB菌液10%；酒糟8%；大曲粉2%；豆饼粉1.5%；营养盐0.11%；乙酸钠0.1%；酵母膏0.1%；硫酸铵0.05%；磷酸氢二钾0.04%；硫酸镁0.02%；黄水8%；酒尾5%；底锅水适量。

1.3 微生物计数培养基

微生物计数培养基分别采用细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）、放线菌培养基（高氏1号琼脂培养基）、真菌培养基（马丁（Martin）-孟加拉红琼脂培养基）、巴氏梭状芽孢杆菌合成培养基。

2 方法

2.1 窖泥培养

配制8种窖泥配方，将温度控制在40℃，培养60 d，每种窖泥3个重复。

2.2 泥样微生物分析采用稀释平板计数法

用接种匙称取8种方案的0.5 g新鲜窖泥于4.5mL无菌水中，置于30℃的摇床中振荡30～40min。再从中用移液管吸取0.5 mL菌液到盛有4.5 mL无菌水的试管中，一直稀释至10-5梯度。从适度的稀释液中分别吸取0.1 mL菌液到已倒好的平板上（每种2个）（事先观察平板是否被污染），然后用涂布器涂匀，将涂布好的培养皿倒置放于培养箱中。细菌在35℃下培养1～2 d。同时对细菌做厌氧培养，在真空干燥箱中抽真空至0.08 MPa，在35℃条件下培养3～4 d。真菌在30℃下培养2～3 d，芽孢杆菌30℃下培养1～2 d，在真空干燥箱中抽真空至0.08 MPa。放线菌于30℃下培养5～7 d。

2.3 理化分析方法

氨态氮的测定采用纳氏试剂比色法，样品需用新鲜窖泥，同时测定水分，以换算成绝干样的含量；水分及挥发物测定采用恒重法，腐殖质的测定采用重铬酸钾氧化法，有效磷的测定采用碳酸氢钠法，pH值采用pH计测定，钙的测定采用高锰酸钾滴定法；白酒总酸、总酯及组成酸、酯的测定参考国家标准GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中总酸、总酯的测定方法。

2.4 感官评定、理化评定

采用赵长青等方法[20]，对8块窖泥进行感官和理化评定，结果见表1和表2。

表1 窖泥感官质量标准表(总分60分)

表2 窖泥理化、微生物指标评定表(总分40分)

2.5 窖泥配方细菌多样性分析

窖泥送上海美吉生物有限公司完成。具体方法如下：采用 FastDNA® SPINKitforSoil对8个的窖泥配方细菌DNA进行提取。以不同配方窖泥细菌总DNA为模板，引物采用细菌16S rRNA V4—V5 区引物515F（5′-148-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）和907R 149 （5′-CCGTCAAATTCMTTTRAGTTT-3′）进行Touch Down PCR扩增,利用Illumina高通量测序仪对8个窖泥细菌DNA PCR扩增产物进行测序分析，为了确保实验数据的准确性及普遍性，需对获得的原始序列进行适当的筛选，去掉低质量的序列，进而获得满足后续分析要求的高质量序列。通过与核糖体数据库（ribosomal database project，RDP）已知序列的比对，修剪适配器和核糖体标签来减少测序错误率。利用微生物生态学的定量分析（quantitative in sights into microbial ecology，QIIME）平台对窖泥细菌DNA序列进行高级生物信息分析，每个样品剩余的高质量序列用于划分操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。在97%相似度的OTUs进行同源性比对的基础上，评估窖泥样品细菌的丰富度（Chao指数）和多样性（Shannon指数）。此外，主成分分析（principal component analysis，PCA）用来反映不同窖泥样本之间细菌组成的差异。

图1 夹泥发酵

2.6 生产试验

按窖泥配方X8制备的窖泥，将窖泥放置于竹筒中，将竹筒放置于浓香型白酒窖池糟醅中层（图1I），A、B糟层均放置装满窖泥的竹筒（竹筒表面密布小孔），每窖池放置竹筒180个，共90 kg窖泥；共进行3个重复试验。按正常工艺发酵60 d，蒸酒，取酒进行气相色谱分析。

2.7 数据处理

采用sigmaplot14进行绘图；采用spss和excel进行数据处理。

3 结果与讨论

3.1 细菌有氧计数

采用菌落计数的方法，对有氧条件下不同发酵时间的平板进行细菌菌落计数，结果见图2。

图2 有氧条件下的细菌数

分析图2可知，8个方案除X6方案在第40天达到菌落最大值以外，其余方案均在第60天达到最大菌落数，每方案最大菌落数分别为：98.7（第60天）、67.6（第60天）、42（第60天）、78.7（第60天）、76.4（第 60 天）、61.2（第 40 天）、37.7（第 60 天）、127.5（第60天）（×105cfu/mL），可见，60 d发酵窖泥在有氧条件下，X8在60 d时，细菌数最大菌落数为127.5（×105cfu/mL），其次是方案1，在60 d时最大菌落数为98.7（×105cfu/mL）。

3.2 细菌无氧计数

采用菌落计数的方法，对无氧条件下不同发酵时间的平板进行细菌菌落计数，结果见图3。

图3 无氧条件下细菌菌落数

分析图3可知，方案X1到方案X8最大菌落数分别为：151.7（第60天）、137.2（第60天）、32.1（第60天）、75.8（第40天）、77.2（第40天）、79.2（第60天）、89.8（第60天）、145.7（第60天）（×105cfu/mL），可见，发酵窖泥在无氧条件下，8个方案中最大菌落数为X1，其细菌数最大菌落数为157.1（×105cfu/mL）；其次是X8在60 d时最大菌落数为145.7（×105cfu/mL），将二者菌落数进行成对数据T检验，其Sig=0.624＞0.05，表明二者差异不显著。

3.3 放线菌计数图

采用菌落计数的方法，对无氧条件下不同发酵时间的平板进行放线菌菌落计数，结果见图4。

图4 无氧条件下放线菌菌落数

分析图4可知，总体上看，放线菌菌落数，0～20 d时，逐渐降低，20～60 d时，菌落数逐渐增加，60 d时，方案X8菌落数最多，达到26（×105cfu/mL）,其次是方案X4，菌落数达16（×105cfu/mL）。

3.4 芽孢杆菌

采用平板菌落计数的方法，对无氧条件下不同发酵时间的平板进行芽孢杆菌菌落计数，结果见图5。

图5 无氧条件下芽孢杆菌菌落数

分析图5可知，8个方案中芽孢杆菌最大值为方案X8，其芽孢杆菌在第60天达到53.4（×105cfu/mL），其次是方案4，为49.6（×105cfu/mL）。

3.5 真菌

采用平板菌落计数的方法，对无氧条件下不同发酵时间的平板进行真菌菌落计数，结果见图6。

图6 无氧条件下真菌菌落数

分析图6可知，在60 d时，真菌菌落在方案X4达到最大值32.4（×105cfu/mL），其次为方案X8，真菌菌落达到17.3（×105cfu/mL）。

通过以上分析，可知X8方案中的放线菌、细菌（有氧和无氧）、芽孢杆菌比其他方案都多，真菌X4方案最多，X8方案其次，总体上看，X8方案为最优方案。

3.6 理化性质

对8个窖泥培养方案进行氨态氮、速效钾、有效磷、pH值和含水量分析，结果见表3。

采用表1和文献对窖泥理化性质进行分析，结果表明，X8和X4较优。

基于表2对8个窖泥方案进行分析，结果见表4。

表3 8个窖泥培养方案理化分析

表4 8个窖泥培养方案的感官评定结果

从表4可知，方案8感官评价较好。

3.7 窖泥群落结构分析

利用Illumina Miseq高通量测序技术对窖泥细菌DNAPCR产物进行测序分析，通过数据库比对得到窖泥细菌的种类，并进一步计算各种细菌所占细菌总数的比例（即相对含量），结果见图7。

图7 不同窖龄窖泥与8个人工窖泥细菌群落结构分析

从图7可知，4年、10年、50年和100年窖底泥中细菌以厚壁菌门（Firmicutes）最多，占细菌总体群落结构的90%以上。由于该门是原核生物界中一类细胞壁厚度为10～50 nm细菌的高级分类单元，包括一大类细菌，多数为革兰氏阳性，有细胞壁结构，少数缺乏细胞壁而不能被革兰氏方法染色，如柔膜菌纲（Mollicutes）（如支原体），但也和其他革兰氏阳性菌一样缺乏第二层细胞膜。厚壁菌门细胞壁含肽聚糖量高，为50%～80%，细胞壁厚10～50 nm，革兰氏染色呈阳性。厚壁菌门多为球状或杆状，也有不规则杆状、丝状或分枝丝状等；很多厚壁菌可以产生芽孢，它可以抵抗脱水和极端环境。很多环境中都可找到芽孢，很多著名的病原菌都能产生芽孢；厚壁菌门原本包括所有革兰氏阳性菌，主要由芽孢杆菌纲(Bacilli)、梭菌纲(Clostridia)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、热石杆菌纲(Thermolithobacteria)及一些不确定的遗传类群组成，其中芽孢杆菌纲和梭菌纲构成了厚壁菌门的主体；在8个人工窖泥中，厚壁菌门占细菌群落总量最大的为X4，相对比例达到近70%，其次为X8占55%左右。

在8个人工窖泥中，变形菌门（Proteobacteria）也是群落结构中相对比例较高的一个门，为革兰氏阴性菌，其外膜主要由脂多糖组成。很多变形菌门细菌利用鞭毛运动，但有一些非运动性的种类，或者依靠滑行来运动。此外还有一类独特的黏细菌，可以聚集形成多细胞的子实体。变形菌门包含多种代谢种类。大多数细菌为兼性或者专性厌氧及异养生活，但有很多例外。很多并非紧密相关的属可以利用光合作用储存能量，因其多数具有紫红色的色素，被称为紫细菌，其中X1中几乎占了细菌群落结构的50%，X4和X8中分别占了10%和15%。

3.8 生产实验

取发酵60 d的蒸馏原酒，进行气相色谱检测，结果如表5。

对试验组和对照组的主要乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、总酸、总酯采用配对数据T检验进行比较，结果表明：试验组与对照组间乙酸乙酯（Sig=0.111＞0.05）、乳酸乙酯（0.05＞Sig=0.022＞0.01）差异不显著，试验组与对照组间己酸乙酯（Sig=0.001＜0.01）、丁酸乙酯（Sig=0.002＜0.01）、总酯（Sig=0.001＜0.01）、总酸（Sig=0.009＜0.01）差异极显著。

表5 原酒中主要风味物质分析

4 结论

本项目通过对8个人工窖泥方案进行细菌、真菌、放线菌、芽孢杆菌平板计数分析、窖泥的理化分析、细菌群落结构比较分析，结果表明，添加L.fusiformis-ep-SigB发酵液的X8号窖泥配方具有较好的各项指标，为最优窖泥配方。

采用添加L.fusiformis-ep-SigB发酵液的X8号方案进行窖泥制备，对发酵60 d的窖泥采用夹泥发酵工艺进行生产试验，结果表明，试验组与对照组间乙酸乙酯（Sig=0.111＞0.05）、乳酸乙酯（0.05＞Sig=0.022＞0.01）差异不显著，试验组与对照组间己酸乙酯（Sig=0.001＜0.01）、丁酸乙酯（Sig=0.002＜0.01）、总酯（Sig=0.001＜0.01）、总酸（Sig=0.009＜0.01）差异极显著，本试验成功筛选出可用于浓香型白酒的窖泥配方。