瓜蒌薤白半夏汤促进2型糖尿病合并急性心肌缺血大鼠内皮祖细胞动员的作用及其机制

郑梦梦, 赵启韬， 周继栋， 傅旎旎， 胡超群， 荀丽英

(1.山东中医药大学药学院， 山东 济南 250355； 2. 山东中医药大学中医学院， 山东 济南 250355)

目前，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病，我国糖尿病的患病率呈快速上升的趋势[1].高血糖引起的血管内皮损伤，可引致一系列心血管疾病，如高血压、冠心病、动脉粥样硬化、心力衰竭及心肌梗死等.糖尿病患者患冠心病的危险程度是非糖尿病人群的2～4倍[2-3].

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是修复机体血管内皮层的重要力量，其功能状态反映了机体修复血管损伤的能力.EPCs动员能力的负性调节是导致糖尿病血管病变的关键因素.糖尿病患者外周血中内皮祖细胞(circulating endothelial progenitor cells，CEPCs)的数目随病变的程度而下降[4].EPCs动员功能的低下是导致糖尿病患者CEPCs水平低下、血管损伤修复能力减弱的直接原因，也是糖尿病血管并发症的关键致病因素.

现代中医临床研究证明，瓜蒌薤白半夏汤(Gualou Xiebai Banxia decoction，GXB)可用于痰浊壅塞胸膈、胸阳痹阻、胸背疼痛和不得安卧的胸痹证[5-7].对应西医临床的糖尿病合并冠心病心绞痛、心肌梗死、慢性心力衰竭和急性脑梗死等心脑血管疾病，均显示出显著的疗效,且不良反应轻微[8-9].然而，目前相关其分子机制和细胞信号调控靶点的研究尚处于初步阶段.本研究以2型糖尿病合并急性心肌梗死(type 2 diabetes complicated with acute myocardial ischemia,T2DM-AMI)大鼠模型为研究对象，经GXB干预，连续检测模型大鼠AMI后7 d外周血中CEPCs含量以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase,eNOS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)含量变化，绘制7 d动态变化曲线，以明确GXB对EPCs的动员作用及机制，并从祖细胞层次阐明中药祛痰散结的可能作用机制.

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性 Wistar 大鼠，220～250 g，SPF级，由山东鲁抗动物实验中心提供，许可证编号：SCXK(鲁)20130001.饲养环境：室温 23～25 ℃，相对湿度为35%～65%.

适应性饲养一周后，168只大鼠随机分为3组，对照、模型、GXB组，每组56只.每组再分为7个亚组，即1～7亚组，每亚组8只大鼠.GXB组每天给予质量分数20 g/kg的GXB灌胃给药，对照组和模型组给予同容积生理盐水.T2DM造模成功后，各组大鼠连续给药7 d.第7天给药30 min后，实施冠状动脉结扎手术，对照组实施假手术.手术后各组大鼠继续灌服GXB或生理盐水，直至被处死.

1.2 药品与试剂

瓜蒌薤白半夏汤(GXB)：瓜蒌240 g、薤白900 g、半夏120 g、黄酒250 mL，加水至盖过药材浸泡2～3 h，水开后小火煎煮20 min，倒出第1份药液.加热水浸过药物煎煮15 min倒出第2份药液，合并两次的水煎液浓缩至为生药质量浓度1 g/mL的煎液.

PE标记的小鼠抗大鼠CD34单克隆抗体(Abcam，ab187284), FITC标记的小鼠抗大鼠VEGFR-2抗体(Abcam，ab184903)；链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)：SIGMA 公司；总胆固醇(TC)测定试剂盒、甘油三酯(TG)测定试剂盒、高密度脂蛋白(HDL)测定试剂盒、低密度脂蛋白(LDL)测定试剂盒：北京信利来生物科技有限公司，20131212；肌酸激酶(CK)试剂盒、肌酸激酶同工酶 MB(CK-MB)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、α剂羟丁酸脱氢酶试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司(20130612).

高脂乳配制：参考石鹤坤等[10]方法，胆固醇、猪油、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶、吐温-80、丙二醇、水体积比为10∶20∶2∶1∶20∶20∶30.方法是将猪油加热融化，加入胆固醇、胆酸钠和丙基硫氧嘧啶，搅拌均匀，再加入吐温-80、丙二醇和蒸馏水，待固体完全溶解后，冷却至室温，得乳剂.

1.3 造模方法

高血脂模型大鼠制备：造模组大鼠灌服每天高脂乳，用量为10 mL/kg同时喂以普通饲料.空白对照组灌服相当剂量的生理盐水并喂以普通饲料.分别于灌服高脂乳后第 14、21天，乙醚麻醉大鼠后眼眶取血，连续两次测定血浆 TC，TG，LDL，HDL.测试数据取平均值，其中 TC，TG，LDL 升高，HDL 降低，与对照组比较有统计学差异(P<0.05)，即视为高脂血症动物模型制作成功.

2型糖尿病大鼠模型制备：将造模成功的高脂血症大鼠，过夜禁食后称体质量. 大鼠腹腔注射质量分数为40 mg/kg STZ.3 d后，大鼠空腹18 h，尾静脉采集血样，检测血空腹葡萄糖含量.同时，所有大鼠给予葡萄糖水(质量分数2 g/kg)灌胃，进行口服葡萄糖耐量实验(oral glucose tolerance test, OGTT)，2 h后测取餐后血糖.将空腹血糖浓度大于10 mmol/L或者餐后血糖浓度大于16.7 mmol/L 的大鼠视为高血糖造模成功大鼠.

T2DM-AMI模型的制备：糖尿病大鼠模型成立后，进行冠状动脉结扎，并在手术后停止给予高脂乳.参考赵启韬等[11]的方法，大鼠质量分数10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉后，连接生物机能实验系统，进行气管插管，行人工呼吸.左侧第3、4 肋间开胸，剪开心包，暴露心肌，并将圆形无创伤缝合针6/0丝线置于左冠状动脉前降支起始部下2 mm处，结扎，以心肌颜色变暗红色为结扎成功的标志.

1.4 5项心肌酶谱检测

腹腔动脉取血5～8 mL，低温分离血浆(4 ℃，3 000 r/min，15 min)，取上层血浆，按各试剂盒说明书进行操作，用半自动生化分析仪分别测定血浆5项心肌酶(CK、CK-MB、LDH、AST、α-HBDH)含量.

1.5 内皮祖细胞动员检测

在冠脉结扎手术后的1～7 d，分别对上述3组的1～7亚组大鼠，连续实施水合氯醛麻醉、腹主动脉取血、处死、取心脏，并利用流式细胞仪检测每只大鼠每毫升血液中CEPCs的数量.

1.6 流式细胞仪检测

CEPC细胞表面既表达干细胞的标志蛋白，如CD34等，也表达血管内皮细胞的标志蛋白，如vWF等[12].因此，本研究将表面同时表达CD34、vWF的单核细胞(MNC)作为内皮祖细胞.取新鲜全血，质量分数4%的乙二胺四乙酸二纳(ethylenediaminetetra acetic acid disodium salt,EDTA-2Na)抗凝，以PE-CD34抗体和异硫氰酸荧光素标记的血管假性血友病因子(FITC-vWF)抗体共同孵育30 min；溶血素(双蒸水1∶10稀释)室温避光裂解10 min.然后加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)终止反应，1 200 r/min离心5 min，弃上清.重复清洗后PBS重悬，流式细胞仪检测.

1.7 酶联免疫检测

ELISIA 试剂盒检测血浆中 VEGF、eNOS、NO的水平，具体操作按照试剂盒说明进行.

1.8 统计方法

采用 SPSS 21.0 软件进行两独立样本t检验，两独立样本校正t检验和完全随机设计资料的方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 大鼠血脂水平测定

于灌服高脂乳后第 14天、 21天，对各组大鼠乙醚麻醉后眼眶取血，连续两次测定血浆 TC、TG、LDL和HDL，测试数据取平均值.结果如表1所示，与对照组比较，模型大鼠血浆 TC、TG和LDL 含量显著升高，血浆 HDL 浓度水平均有明显下降(P<0.01)，说明高脂模型造模成功.

组别 nTCTGLDLHDL对照组81.38±0.142.16±0.130.39±0.110.78±0.12模型组89.14±1.019.63±1.201)3.56±1.431)0.34±0.061)

1)与对照组比较P<0.01

2.2 大鼠血糖浓度的测定

连续3 d注射SZT，最后一次注射SZT后的18 h，以及OGTT实验后2 h, 大鼠尾静脉取血.结果如下所示，模型组大鼠空腹血糖和餐后血糖升高极为显著,说明糖尿病模型造模成功.

组别n空腹18 hOGTT 2 h对照组84.69±0.8710.32±1.21模型组818.33±3.451)29.44±2.761)

1)与对照组比较P<0.05

2.3 各组大鼠心肌酶水平

利用生化试剂盒检测各组大鼠血浆中5项心肌酶活性，检测数据表明，与对照组相比，模型组大鼠血清5项心肌酶活性均显著升高(P<0.01).GXB可明显降低该模型鼠血清心肌酶活性.

组别nCKCK-MBASTLDHα-HBDH对照组8278.65±14.02219.56±18.1160.84±23.40136.23±16.40132.21±10.26模型组8898.71±26.551)672.32±35.561)203.56±32.121)535.20±14.281)275.09±28.151)GXB组8391.11±73.812)407.03±64.422)74.75±29.042)303.46±49.962)137.62±24.242)

1)与对照组比较P<0.01；2)与模型组比较P<0.01

1)与对照组比较P<0.01；2)与模型组比较P<0.01

2.4 GXB对T2DM-AMI大鼠CEPCs动员的作用

流式细胞仪检测结果如表4，图2所示，对照组CEPCs含量7 d内无明显变化.模型组大鼠该细胞含量手术后第3天急剧升高，第4天达到峰值，随即迅速下降.GXB组大鼠CEPCs数量心肌缺血后前4 d升高幅度和模型组相似，同样是在缺血后第4天达到峰值，但达到峰值后仍一直维持在较高水平，下降幅度很小(P<0.05).从冠状动脉结扎手术后第5天起，GXB组大鼠血液中CEPCs的含量就一直显著高于模型组(P<0.05).

组别n1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d对照8569.42±48.22352.13±46.23462.79±103.5429.86±79.16479.83±39.87376.94±46.26448.47±86.47模型8569.42±48.22450.37±76.55331.05±49.461751.14±186.441)987.80±106.351)616.99±84.47607.07±59.35GXB8390.26±65.12607.46±49.31498.08±28.251605.43±158.331)1467.67±165.351)2)1239.72±145.21)2)1271.51±187.41)2)

1)与对照组比较P<0.05; 2)与模型组比较P<0.05

1)与模型组比较P<0.05；2)与对照组比较P<0.05

Fig.2 Changes of circulating endothelial progenitor cells in the blood of rats in each group within 7 days

2.5 大鼠血浆VEGF质量浓度变化

采用用ELISIA试剂盒检测各组大鼠血浆VEGF含量，数据表明，对照组含量一直无明显变化，处于基线水平，平稳波动；模型组含量整体呈现上升趋势，其中第4天达到顶峰并开始下降，而GXB组大鼠血浆VEGF含量上升幅度大、速度快，AMI后第5天即达到峰值，从第4天起就一直显著高于模型组大鼠(表5、图3，P<0.05).

2.6 大鼠血浆eNOS活性变化

血浆eNOS活性检测数据表明，对照组含量一直无明显变化，平稳波动.模型组大鼠血浆eNOS活性逐步上升，于AMI后第3天达到峰值并开始下降，但从 AMI 后第2天起一直显著高于对照组大鼠.GXB组大鼠血浆该酶活性 AMI 手术后第2天即显著高于模型组大鼠，而且该酶活性于AMI第3天后仍持续升高，第4天达到峰值并开始下降；但直至处死前一直显著高于对照组和模型组(图4、表6，P<0.05).

组别n1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d对照8304.66±36.21310.12±49.25324.68±26.54331.46±31.11312.41±26.40301.08±19.20310.95±27.44模型8297.97±29.87328.46±65.30357.52±45.211)386.60±54.691)368.03±16.541)309.12±59.501)309.19±64.111)GXB8310.20±24.23346.66±36.14402.40±48.52486.76±43.102)506.87±56.112)538.19±34.332)518.80±47.122)

1)与对照组比较P<0.05; 2)与模型组比较P<0.05

1)与模型组比较P<0.05；2)与对照组比较P<0.05

Fig.3 Changes of plasma VEGF levels in rats in each group

2.9 大鼠血浆NO含量变化

对照组大鼠血浆NO含量一直无明显变化，平稳波动.模型组含量整体呈现上升趋势，其中第4天达到顶峰并开始下降，但AMI后7 d内一直显著高于对照组大鼠.GXB组大鼠血浆NO含量变化曲线与模型组大鼠类似，即从第2天即明显升高，第4天达到峰值，其后开始下降，但整体处于较高水平，且显著高于模型组 (表7、图5，P<0.05).

组别n1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d对照组81.75±0.241.88±0.331.59±0.251.72±0.361.47±0.061.80±0.111.67±0.21模型组82.19±0.252.39±0.351)2.92±0.251)2.42±0.341)2.83±0.361)2.67±0.151)2.39±0.181)GXB组82.94±0.251)3.40±0.361)2)3.32±0.441)4.61±0.121)2)4.18±0.341)2)3.82±0.251)2)3.69±0.311)2)

1)与对照组比较P<0.05; 2)与模型组比较P<0.05

1)与模型组比较P<0.05；2)与对照组比较P<0.05

Fig.4 Changes of plasma eNOS activity in each group of rats

1)与模型组比较P<0.05；2)与对照组比较P<0.05

图5 各组大鼠血浆NO含量变化

Fig.5 Changes of plasma NO in rats in each group

组别n1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d对照组823.54±0.6622.45±3.1025.23±2.5523.34±3.9824.62±1.5821.18±2.5523.89±1.97模型组824.11±3.4725.91±2.6635.36±2.981)36.14±4.121)32.39±3.871)28.61±1.1121.91±3.14GXB组828.07±2.6834.37±5.661)50.22±4.321)2)52.65±5.361)2)46.70±3.781)2)51.08±3.651)2)42.13±5.781)2)

1)与对照组比较P<0.05; 2)与模型组比较P<0.05

3 讨论

随着疾病谱的逐渐演变，2型糖尿病已经成为当代社会的常见病.在诸多并发症中，心血管疾病是糖尿病患者致死的主要原因.关于心血管疾病的发病机制，“内皮损伤反应学说”被多数学者接受.现代研究证明，骨髓中EPC动员的过程与VEGF、eNOS和NO等细胞因子有关[13-14].对eNOS-/-小鼠注入野生型EPCs后，被阻断的血管新生恢复正常，表明EPC的动员依赖于eNOS[15].2型糖尿病患者骨髓内皮祖细胞动员呈现负性调节，患者 CEPCs数目随病变的程度而下降.研究发现，2型糖尿病患者外周血中EPCs的数量与患者空腹血糖及糖化血红蛋白呈负相关，表现为EPCs数量减少，这种减少与EPCs寿命缩短或骨髓EPCs动员减少有关，其中寿命缩短可能由于细胞增殖减少和细胞死亡加速所致[16].

关于中药对EPCs动员的体内研究，多数是静态研究，即选取某一时间点，检测对照组、模型组、药物干预组患者或模型动物组细胞含量，分析各组间的差异.而骨髓EPCs的动员是一个动态变化的过程，静态的研究不能全面反应药物对该过程的干预作用.而本实验对T2DM-AMI模型大鼠7 d内EPCs动员的动力学进行了描述,更加准确地反映EPCs动员情况.

GXB是防治AMI、冠心病和高脂血症的常用的复方中药，它安全、有效而且价格低廉，因而被中医临床广泛使用.本课题组前期研究表明GXB对高血脂合并急性心肌梗死大鼠干预效果显著[17].本课题通过设计高血糖、高血脂伴急性心肌缺血大鼠模型，以GXB干预，不同时间点采集外周血，测定CEPCs含量，绘制其变化曲线，明确GXB对EPCs动员功能的影响.检测各组动物体内 EPCs动员的关键细胞因子的表达水平，研究GXB对EPCs动员关键细胞因子的调控作用.本研究发现GXB可以增加T2DM-AMI大鼠外周血CEPCs的浓度，上调血浆VEGF，eNOS和NO表达水平.该发现表明GXB可能通过上调血浆中VEGF，eNOS，NO的表达或分泌来调节骨髓EPCs的动员.