不良妊娠结局与亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性的关系

梁玲芝，许美芬，陈贤君，潘一红

（台州市中心医院，浙江 台州318000）

不良妊娠结局包括异位妊娠、自然流产、胚胎停育、出生缺陷、死胎和足月低质量新生儿等，确切病因至今不明，多数学者认为是环境和遗传因素相互作用的共同结果，而叶酸摄入不足或亚甲基四氢叶酸还原酶 （methylenetetrahydrofolate reductases，MTHFR）基因多态性导致的叶酸不能被机体有效利用，可能会导致不良妊娠结局[1-2]。MTHFR编码的酶活性降低，可使同型半胱氨酸（Hcy）升高，Hcy升高可导致腺苷蛋氨酸与腺苷Hcy的比值降低，使DNA甲基转移酶受抑制，出现DNA低甲基化，可造成染色体不分离，且Hcy对血管内皮细胞的损伤导致母体与胎儿间营养、气体交换障碍，胎儿宫内缺血缺氧进而生长受限，高Hcy进一步影响叶酸在机体内的代谢和利用，其伴有的胚胎毒性作用将进一步导致不良妊娠结局。本文通过探讨不良妊娠结局与MTHFR C677T多态性的相关性，分析遗传因素在不良妊娠结局致病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年12月-2017年9月在本院诊治的不良妊娠结局的育龄期妇女139例为病例组，年龄 18-39 岁，平均（28.5±4.6）岁。 不良妊娠结局类型包括异位妊娠80例、自然流产42例和胚胎停育17例。另选取同期体检健康的育龄期妇女142例为对照组，对照组需至少有一次正常生育史，无不良生育史，无家族性遗传病史，无甲状腺功能亢进、糖尿病等内分泌疾病；染色体核型正常，生殖系统和内分泌功能正常，年龄19-39岁，平均（29.8±5.0）岁。两组年龄分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法 （1）试剂与仪器：ABI Stepone Plus实时荧光定量PCR仪购于美国应用生物系统公司，DNA提取试剂盒购于苏州天隆生物技术有限公司，叶酸代谢能力测定试剂盒购于江西诺德医疗器械有限公司。Architect I2000SR仪器购于美国雅培公司。（2）检测方法：收集两组妇女EDTA抗凝管外周血1～2mL，无抗凝剂管外周血2～4mL。按照说明书提取全血基因组DNA。采用荧光定量PCR技术检测MTHFR C677T多态性。C677T位点的引物序列 为 F:5’-CAAAGGCCACCCCGAAGC-3’，R:5’-AGGACGGTGCGGTGAGAG-3’。PCR扩增程序为95℃总变性 10分钟，95℃变性 15秒，60℃退火 40秒，40个循环后60℃采集荧光。根据荧光采集量判断677位点是纯合野生型 （CC型），杂合突变型（CT型）或纯和突变型 （TT型）。采用Architect I2000SR仪器的全自动化学发光免疫分析技术检测血浆Hcy。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计学处理，计量资料以（±s）表示，多组间均数采用方差分析，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 病例组和对照组标本检验结果符合Hardy-Weinberg平衡检验 （χ2=2.964，P＞0.05；χ2=2.101，P＞0.05），证明研究对象具有群体代表性。

2.2 基因型和等位基因分析 MTHFR C677T三种基因型中TT型在病例组中分布频率显著升高，同时CC基因型在病例组中表达频率显著降低，与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。发生不良妊娠结局的风险，携带CT基因型为CC基因型的 1.47 倍（OR=1.4748，95%CI为 0.879～2.473），TT基因型为CC基因型的2.29倍 （OR=2.288，95%CI为 1.151～4.546）；CT+TT基因型为 CC基因型的1.68 倍（OR=1.678，95%CI为 1.042～2.702）。此外，T等位基因在病例组中表达频率高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与C等位基因比较，T等位基因会增加不良妊娠结局风险（OR=1.590，95%CI为 1.126～2.245）。 详见表 1。

表1 两组MTHFR C677T位点基因频率和等位基因频率比较[n（%）]

2.3 Hcy检测 病例组和对照组的Hcy值分别为（9.55±2.38）μmol/L 和（8.05±2.05）μmol/L，病例组高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；病例组各不良妊娠结局之间Hcy值差异无统计学意义（P＞0.05），详见表 2。

表2 病例组各不良妊娠局之间Hcy值比较（±s）

表2 病例组各不良妊娠局之间Hcy值比较（±s）

不良妊娠结局 n Hcy（μmol/L）异位妊娠 80 9.37±2.11自然流产 42 9.87±2.72胚胎停育 17 9.61±2.69

3 讨论

随着现代分子生物学技术的进步，越来越多的研究表明，在影响不良妊娠结局的诸多因素中，遗传因素占了很大比例，而MTHFR基因多态性也是其中的一大部分。如MTHFR酶活力降低，提供的甲基与5-甲基四氢叶酸生成的量减少，则未甲基化的dUMP和甲硫氨酸循环中无法代谢Hcy，使其增多[3]。MTHFR基因突变位点中部分多态位点的错义突变是导致酶活性降低或缺失，及热稳定性改变的主要机制[4]。当前研究报道较多且与人类疾病关系较大的多态位点是C677T和A1298C。MTHFR基因677位点核苷酸C＞T使编码的氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸，导致MTHFR热稳定性和酶活性下降，同时阻碍Hcy的甲基化途径，从而导致Hcy在体内的蓄积。

关于MTHFR基因多态性与不良妊娠结局的关系研究较热门。国内学者发现，MTHFR C677T突变可能是早期不良妊娠结局的遗传易感性因素，TT基因型的个体发生不良妊娠结局的风险很高[5]，且不良妊娠结局患者MTHFR C677T的等位基因频率明显高于正常组，证实T等位基因是引发不良妊娠结局的高危因素[6]，与本研究结果相符。有报道MTHFR C677T和A1298C多态性位点在染色体上为反式排列，存在连锁不平衡性，并指出这两个多态性位点基本上不存在于同一条染色体上，即使存在也会对MTHFR酶的活性产生巨大影响[7]，而这两个位点联合突变的人群数量极少，可能在胚胎或胎儿时期以自然流产的形式消失，是自然选择的结果。

本文应用实时荧光定量PCR技术对叶酸代谢循环中重要酶相关MTHFR基因C677T位点多态性进行检测，并进一步分析了此基因位点多态性与不良妊娠结局的关系。结果提示，MTHFR基因C677T多态性位点TT型在病例组中分布频率显著升高，同时CC基因型在病例组中表达频率显著降低（P＜0.05），T等位基因在病例组中表达频率高于对照组（P＜0.05），说明育龄妇女携带MTHFR C677T位点的T等位基因及CT、TT和CT+TT基因型较C等位基因及CC基因型不良妊娠结局风险增加。

本研究与国内外众多学者的研究结果基本吻合，除了基因型分布及等位基因频率不同，可能与MTHFR基因多态性位点存在民族和地域差异性有关。MTHFR另一个常见多态性位点A1298C也可能使MTHFR活性下降，和C677T之间存在着联合作用。由于实验条件有限，今后将进一步扩大相关位点及样本数量进行研究。

本研究的价值在于通过对不良结局妊娠育龄女性进行MTHFR基因C677T位点遗传筛查，针对C677T基因突变的个体通过增加叶酸摄入量有效降低Hcy，改善下次妊娠结局，提高产前筛查和孕期管理。