microRNA-16在人结肠癌组织中的表达及对结肠癌细胞增殖、侵袭、周期和凋亡的影响

王晓明，梁国栋，王岩，杨玉波，刘峰

吉林省肿瘤医院结直肠胃腹部外科，长春 130012

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，随着人们生活水平的提高，其发病率呈逐年上升趋势，研究表明结肠癌的发生发展受多种基因和分子调控，其发病机制仍未完全清楚[1]。因此寻找具有特异性及敏感性的生物标志物具有重要的临床意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种大小为21～23个碱基的单链小分子RNA，通过对靶向mRNA的降解和翻译水平的调控，在肿瘤的发生发展中起着原癌基因和抑癌基因的双重作用[2-3]。已有研究表明，miRNA-16在某些恶性肿瘤（如前列腺癌、肺癌及慢性淋巴细胞白血病）中均表达下降[4-6]，提示miRNA-16是具有抑癌作用的一类miRNA，然而在结肠癌中miRNA-16如何发挥抑癌基因的作用及具体机制尚不明确。本研究分析miRNA-16在结肠癌组织和正常结肠组织中的表达情况，并探讨miRNA-16在结肠癌细胞增殖、侵袭、周期和凋亡中的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2015年12月至2016年12月于吉林省肿瘤医院接受结肠手术的30例结肠癌患者的结肠癌组织、癌旁组织（距肿瘤边缘2 cm以内）及正常结肠组织标本。30例结肠癌患者中，男13例，女17例；年龄41～60岁，中位年龄48岁；低分化17例，中高分化13例；有淋巴结转移18例，无淋巴结转移12例。所有患者术前均未行化疗或放疗。

1.2 细胞系和相关试剂

人结肠癌细胞系SW480购自北京医学科学院细胞库。IMDM培养基、胎牛血清、胰酶均购自美国HyClone公司，Cell Culture Insert购自美国Millipore公司，Matrigel胶、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）试剂盒及细胞周期试剂盒均购自美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 将SW480细胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素的IMDM培养液中，37℃、5%CO2培养箱中每2～3天传代一次。

1.3.2 RT-PCR检测基因表达水平 应用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，将RNA逆转录为cDNA。miRNA-16探针序列为5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3'，GAPDH引物序列为5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'。逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，65 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 32 s，共30个循环。应用荧光定量PCR仪检测基因表达，应用2－△△Ct法计算目的基因的相对表达量。△Ct值=目的基因Ct值－内参基因Ct值，△△Ct值=转染组△Ct值－对照组△Ct值。将基因产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描电泳结果。每次实验平行做5个样本，实验重复3次。

1.3.3 细胞转染 按照LipofectamineTM2000转染说明书，将miRNA-16特异性过表达质粒转染至对数生长期的无血清培养的SW480细胞作为转染组，以未转染的细胞作为对照组，4 h后两组均更换为含体积分数为20%胎牛血清的完全新鲜培养基继续培养48 h。

1.3.4 细胞增殖检测 收集对数生长期的转染组和对照组细胞，调整细胞浓度为1×104/ml，接种于96孔培养板，48 h后加入20 μl噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）孵育4 h，去除上清液，应用150 μl的二甲基亚砜溶解MTT，在波长为570 nm处检测细胞的吸光度（optical density，OD）值，根据OD值的大小计算细胞增殖率，细胞增殖率=（OD48h－OD0h）/OD48h×100%。实验重复3次。

1.3.5 细胞侵袭检测 将Matrigel胶与无血清的IMDM培养基以1∶5比例稀释，将400 μl细胞悬液加入Transwell小室的上室，800 μl全血清加入下室，37℃孵育48 h，去除Matrigel胶，4%多聚甲醛固定10 min，0.005%结晶紫染色40 min。200倍显微镜下观察透过膜的细胞数，随机取5个视野计数取平均值。实验重复3次。

1.3.6 细胞周期检测 将SW480细胞转染48 h后用胰酶消化，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗涤细胞2次，将细胞悬液缓慢加入预冷的70%乙醇中固定，4℃过夜后离心收集细胞，加入500 μl PI避光孵育30 min，应用流式细胞仪Cell Quest软件检测细胞周期。每次实验平行做5个样本，实验重复3次。

1.3.7 细胞凋亡检测 取对数生长期的SW480细胞，采用胰酶消化，1000 r/min离心5 min，弃上清，1×binding buffer洗涤细胞沉淀1次，100 μl 1×binding buffer重悬细胞，加入5 μl AnnexinV-FITC及5 μl PI染色，室温避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。每次实验平行做5个样本，实验重复3次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对-数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织、癌旁组织和正常结肠组织中miRNA-16表达水平的比较

结肠癌组织、癌旁组织和正常结肠组织中miRNA-16的表达水平分别为（0.375±0.156）、（1.000±0.020）和（0.941±0.102），3组比较，差异有统计学意义（F=304.978，P＜0.01）；结肠癌组织中miRNA-16的表达水平明显低于癌旁组织和正常结肠组织（t=21.766，P＜0.01；t=16.633，P＜0.01）。

2.2 结肠癌组织中miRNA-16的表达水平与结肠癌患者临床特征的关系

有淋巴结转移、疾病进展结肠癌患者结肠癌组织的miRNA-16表达水平均低于无淋巴结转移、疾病未进展的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同年龄、性别、分化程度、结肠癌家族史、肿瘤直径、肿瘤部位、TNM分期的结肠癌患者结肠癌组织的miRNA-16表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

2.3 转染组和对照组细胞中miRNA-16表达水平的比较

RT-PCR检测结果显示，转染组中miRNA-16凝胶条带的亮度明显强于对照组，其灰度值分别为（2.20±0.23）和（1.01±0.02），差异有统计学意义（t=3.986，P＜0.01）。

2.4 miRNA-16过表达对SW480细胞增殖和侵袭能力的影响

MTT检测结果显示，转染组和对照组细胞的增殖率分别为（0.78±0.12）%和（0.81±0.28）%，差异无统计学意义（P＞0.05）。Transwell实验结果显示，转染组中穿透Matrigel胶的SW480细胞数量为（28.0±3.0），明显少于对照组的（91.0±4.0），差异有统计学意义（t=9.617，P＜0.01）。

2.5 miRNA-16过表达对SW480细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果显示，转染组和对照组中G1期、S期及G2期细胞所占比例比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

2.6 miRNA-16过表达对SW480细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示，转染组细胞的早期凋亡率为（13.770±3.460）%，明显高于对照组的（1.250±0.410）%，差异有统计学意义（t=13.917，P＜0.01）；转染组和对照组细胞的晚期凋亡率分别为（3.210±1.120）%和（2.980±1.450）%，差异无统计学意义（t=0.486，P=0.631）。

表1 结肠癌组织中miRNA-16的表达水平与结肠癌患者临床特征的关系（n=30）

表2 对照组和转染组中G1期、S期和G2期SW480细胞所占比例的比较（%，±s）

表2 对照组和转染组中G1期、S期和G2期SW480细胞所占比例的比较（%，±s）

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3 讨论

miRNA-16缺失、突变甚至重排与多种肿瘤的发生密切相关[7-8]。近年来国内外研究表明，miRNA-16在多种实质性肿瘤组织中均呈低表达，其表达水平与肿瘤的发展阶段呈负相关[9-12]。本研究结果显示，miRNA-16在结肠癌组织中低表达，且其表达水平与淋巴结转移情况有关，但miRNA-16对结肠癌细胞生物学影响的研究结论不一。

细胞黏附和侵袭是肿瘤细胞发生远处转移的重要因素，本研究通过体外实验探索了miRNA-16过表达对结肠癌细胞远处转移的影响，结果发现其可以抑制结肠癌细胞和组织的侵袭能力。杨天权等[13]在裸鼠模型中发现，miRNA-16通过调控NF-κB1、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表达，抑制胶质瘤细胞的侵袭和生长。Wang等[14]研究发现，miRNA-16-1-3p通过调控Twist1的表达，抑制胃癌的侵袭和转移。

本研究结果显示，结肠癌组织中miRNA-16的表达水平明显低于癌旁组织和正常结肠组织（P＜0.01），有淋巴结转移、疾病进展结肠癌患者结肠癌组织的miRNA-16表达水平均低于无淋巴结转移、疾病未进展的患者（P＜0.05）。汪旭东等[15]研究证实，miRNA-16在肺腺癌细胞中低表达，并可以抑制肺腺癌细胞增殖，促进肺腺癌细胞早期凋亡。Patel等[16]研究发现，miRNA-16通过下调抑制癌基因BMI1，诱导乳腺癌细胞线粒体依赖的细胞凋亡。本研究进一步探讨了miRNA-16过表达对结肠癌细胞增殖、侵袭、周期和凋亡的影响，结果发现，转染组和对照组的细胞增殖率和细胞周期比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），但miRNA-16过表达能够抑制结肠癌细胞侵袭，促进结肠癌细胞早期凋亡。

本研究具有一定的局限性。已有研究报道，miRNA-16低表达与肿瘤预后具有一定的关系，miRNA-16可以通过调控Bcl-2蛋白的表达，逆转结肠癌细胞的耐药性[17-18]，这部分研究在本文中并未体现，更多的试验（例如体内动物和临床试验等）亟待开展。

综上所述，miRNA-16在多种肿瘤的发生过程中发挥着重要作用，对miRNA-16的深入研究将为相关肿瘤的治疗提供新的思路并有望成为结肠癌靶向治疗的新靶点。