ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在结直肠癌中的表达及意义

杨学民，李朝路，李兆阳

1北京市石景山医院普外科，北京 100043

2中国医科大学实验动物部，沈阳 110001

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，在发达国家发病率居第2位，在中国发病率及病死率呈上升趋势[1-3]。虽然诊断、手术技术不断发展，但是结直肠癌侵袭转移仍是患者术后复发甚至死亡的主要原因[1-2]。结直肠癌等恶性肿瘤的侵袭转移是一个多基因、多步骤、多种信号通路参与的复杂过程，涉及细胞的增殖、黏附、迁移、侵袭转移等过程[1-2]。细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）是一种常见的白细胞分化抗原，能够介导淋巴细胞与肿瘤细胞的黏附，使肿瘤细胞局部附着形成转移灶，促进肿瘤细胞的浸润转移[4]。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）能够介导细胞外基质的降解，为肿瘤细胞的浸润扩散提供充足条件[5]。上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）通过介导细胞间的同质黏附，使细胞间黏附降低，促进肿瘤细胞脱落进入淋巴循环，最终发生扩散[6]。因此探讨ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在结直肠癌发生发展过程中的作用，有助于了解结直肠癌侵袭转移的相关机制，为结直肠癌患者的诊断、预后判断提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2013年1月至2017年10月于北京市石景山医院手术切除的68例经病理检查确诊为结直肠癌患者的结直肠癌组织，其中男48例，女20例；年龄41～78岁，中位年龄59.5岁，＜55岁21例，≥55岁47例；分化程度：高分化21例，中分化17例，低分化30例；肿瘤大小：＜5.0 cm 50例，≥5.0 cm 18例；Dukes分期：A期14例，B期13例，C期25例，D期16例；有淋巴结转移41例，无淋巴结转移27例。另外选取对应的距离结直肠癌组织＞5 cm的68例正常组织作为对照。所有患者在术前均未接受过任何化疗、放疗及生物治疗等。

1.2 主要试剂及材料

兔抗人ICAM-1、MMP-9及E-cadherin多克隆抗体均购自美国Abcam公司，DAB显色试剂盒、SP法免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3 免疫组化法检测ICAM-1、MMP-9及E-cadherin表达情况

组织标本经福尔马林固定后，石蜡标本包埋并连续切成4 μm厚度的切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后用枸橼酸钠缓冲液进行抗原修复，接着根据免疫组化试剂盒采用SP法对石蜡标本进行一抗、二抗孵育，并染色，最后在光镜下观察蛋白的染色情况。选取磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断

ICAM-1及E-cadherin主要表达于细胞膜，当细胞膜上出现棕黄色或棕褐色颗粒说明阳性表达；MMP-9主要表达于细胞质，当细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒说明阳性表达。在高倍镜下随机选取一张切片中的5个视野进行观察，并采用双盲法对染色的细胞进行观察计数。根据细胞的着色程度进行评分：未染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据阳性细胞占视野细胞总数的百分比进行评分：无阳性细胞为0分，＜25%为1分，≥25%且＜50%为2分，≥50%且＜75%为3分，≥75%为4分。二者评分乘积：0分为阴性（－），1～4分为弱阳性（+），5～8分为阳性（++），≥9分为强阳性（+++）。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关分析法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的表达

ICAM-1在结直肠癌组织中的阳性表达率为75.00%（51/68），明显高于癌旁正常组织的10.29%（7/68），MMP-9在结直肠癌组织中的阳性表达率为77.94%（53/68），明显高于癌旁正常组织的22.06%（15/68），E-cadherin在结直肠癌组织中的阳性表达率为32.35%（22/68），明显低于癌旁正常组织的92.65%（63/68），差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin在68例结直肠癌患者的结直肠癌组织及癌旁正常组织中的阳性表达情况比较[n（%）]

2.2 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin阳性表达与结直肠癌临床特征的关系

C+D期、有淋巴结转移及低分化的结直肠癌患者ICAM-1、MMP-9阳性表达率均明显高于A+B期、无淋巴结转移及高中分化的结直肠癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）；C+D期、有淋巴结转移及低分化的结直肠癌患者E-cadherin阳性表达率均明显低于A+B期、无淋巴结转移及高中分化的结直肠癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位结直肠癌组织中ICAM-1、MMP-9及E-cadherin阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

2.3 结直肠癌组织中ICAM-1、MMP-9及E-cadherin表达的相关性

经Spearman相关性分析，结直肠癌组织中ICAM-1与MMP-9表达呈显著正相关（r=0.839，P＜0.01），ICAM-1与E-cadherin表达呈显著负相关（r=-0.597，P＜0.01），MMP-9与E-cadherin表达呈显著负相关（r=-0.896，P＜0.01）。

3 讨论

ICAM-1是一种与细胞黏附、迁移及抗原呈递密切相关的介导分子，在正常情况下，仅少量的ICAM-1表达于淋巴细胞、内皮细胞等细胞表面，而在肿瘤环境下，ICAM-1被大量分泌，参与肿瘤的发生发展[4]。研究显示，ICAM-1基因多态性与结直肠癌的发生发展密切相关[7]。李艳等[8]采用免疫组化法比较了结直肠癌原发病灶、非癌正常组织、结直肠腺瘤组织中ICAM-1的表达，结果表明ICAM-1在非癌正常组织、腺瘤组织及癌组织中阳性表达率依次升高，差异有统计学意义，同时结直肠癌中ICAM-1的表达与Dukes分期及淋巴结转移密切相关，而不与年龄、性别、肿瘤部位等相关。本研究也采用免疫组化SP法检测了68例结直肠癌组织及相应的癌旁正常组织中ICAM-1的表达，结果与李艳等[8]研究结果一致，结直肠癌组织中ICAM-1阳性表达率明显高于癌旁正常组织，同时C+D期、有淋巴结转移及低分化的结直肠癌患者ICAM-1阳性表达率均明显高于A+B期、无淋巴结转移及高中分化的结直肠癌患者，提示恶性程度高的结直肠癌细胞分泌大量的ICAM-1，通过其配体分子促使结直肠癌细胞与淋巴细胞黏附，并局部附着，进而随着淋巴细胞循环进入血液形成转移灶。

表2 ICAM-1、MMP-9及E-cadherin阳性表达与结直肠癌临床特征的关系（n=68）

MMP-9是MMP中分子量最大的一种水解酶，主要是由细胞与细胞间质间的淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等分泌形成。MMP-9能够水解细胞的基底膜和细胞外基质，促进细胞穿过基底膜向邻近组织扩散侵袭，同时还能够促使内皮细胞穿过基底膜并向远处迁移，形成血管，为肿瘤细胞的生长侵袭提供足够的营养物质与空间[5]。本研究采用免疫组化法测定了68例结直肠癌组织及癌旁正常组织中的MMP-9表达，结果表明结直肠癌组织中MMP-9阳性表达率明显高于癌旁正常组织，同时C+D期、有淋巴结转移及低分化的结直肠癌患者MMP-9阳性表达率均明显高于A+B期、无淋巴结转移及高中分化的结直肠癌患者，与多数学者研究结果一致[5,9-10]。而Nikolaeva等[11]研究表明结直肠癌组织中MMP-9阳性表达与淋巴结转移、分化程度及TNM分期无关，与本研究结果不一致，可能源于实验条件的差异、样本量的大小不同等。本研究结果说明高表达的MMP-9为结直肠癌细胞的恶性生长、浸润转移提供了更加充足的空间与营养基础。

E-cadherin是一种介导上皮细胞间黏附，维持细胞极性与分化形态的跨膜蛋白，在肿瘤细胞中，E-cadherin大部分呈现表达量下调或者缺失，致使细胞间黏附减弱，细胞上皮形态发生变化，最终导致肿瘤细胞侵袭转移[6]。本研究免疫组化结果表明，结直肠癌组织中E-cadherin阳性表达率均明显低于癌旁正常组织，同时C+D期、有淋巴结转移及低分化的结直肠癌患者E-cadherin阳性表达率均明显低于A+B期、无淋巴结转移及高中分化的结直肠癌患者，与E-cadherin在大多数肿瘤组织中的表达趋势一致[6]。另外秦乐和曾妍[12]研究还证实了E-cadherin的表达缺失与结直肠癌患者的预后不良密切相关。提示E-cadherin的低表达甚至缺失使结肠癌细胞间的黏附发生了障碍，减弱了结直肠癌细胞间的相互作用，促进了结直肠癌细胞的浸润转移。

同时本研究经Spearman相关性分析得出结直肠癌组织中ICAM-1与MMP-9表达呈显著正相关，ICAM-1与E-cadherin表达呈显著负相关，MMP-9与E-cadherin表达呈显著负相关。另外研究表明胃癌组织中ICAM-1与MMP-9表达呈正相关[13]，食管癌血清中E-cadherin与ICAM-1表达呈负相关[14]，肾上腺皮质肿瘤组织中MMP-9与E-cadherin表达呈负相关[15]。进而提示高表达的ICAM-1、MMP-9，低表达的E-cadherin共同促进结直肠癌的发生及浸润转移。

综上所述，结直肠癌组织中ICAM-1、MMP-9高表达，E-cadherin低表达，三者与结直肠癌的分化程度、Dukes分期及淋巴结转移有关，说明三者的联合检测对结直肠癌恶性程度及侵袭转移能力的判断具有一定的指导意义。