miRNA ：甲状腺癌诊治和预后评估的新型分子标志物

于远东

河南省直第三人民医院健康体检中心，郑州 450006

甲状腺癌是一种常见的内分泌恶性肿瘤，约占全部恶性肿瘤的1.7%，近年来其发病率呈逐年增长趋势[1]。在甲状腺癌中，肿瘤转化可发生在腺体的滤泡中或滤泡旁细胞中。当转化发生在腺体的滤泡中时，引起的甲状腺癌主要包括乳头状甲状腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、滤泡性甲状腺癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）、Hürthle细胞癌、罕见的低分化甲状腺癌（poorly differentiated thyroid carcinoma，PDTC）和间变性甲状腺癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）。当转化发生在滤泡旁细胞中时，引起的甲状腺癌主要为甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）[2]。目前，针对甲状腺癌的治疗方法主要包括手术和放化疗，但在大多情况下效果不理想。血清学检测甲状腺球蛋白和降钙素水平是甲状腺癌诊断和随访的重要手段，但这两种标志物在灵敏度和准确度上具有局限性，因此探索新型的诊断甲状腺癌的方法具有重要意义[3-4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类高度保守的内源性非编码小RNA，近年来，越来越多的miRNA被报道参与肿瘤的发生发展过程。miRNA的表达模式可能代表了肿瘤的恶性程度，其异常表达是恶性肿瘤的重要标志。研究表明，特异性miRNA的表达改变参与某些恶性肿瘤的发生和发展[5]。因此，miRNA表达谱可以为肿瘤的分类、诊断和预后评估提供依据。

1 miRNA与甲状腺癌

细胞增殖、分化和凋亡对维持体内细胞平衡具有重要意义，miRNA表达失调与细胞增殖的激活、凋亡信号通路的失活以及其他遗传变化相关，最终导致肿瘤发生[6]。2005年，He等[7]首次报道了miRNA在甲状腺癌发生中的作用。在甲状腺癌中，miRNA的生物发生过程发生改变[8]。与正常甲状腺组织和良性甲状腺肿瘤组织相比，恶性甲状腺肿瘤组织中参与miRNA形成的Dicer mRNA下调，这种改变与肿瘤的侵袭性相关，例如甲状旁腺扩张、淋巴结和远处转移以及复发，并伴随有BRAF（V600E）突变[9-10]。研究报道，RET突变型MTC患者中与miRNA生物发生相关的某些基因的表达水平高于RET野生型MTC患者，而RAS突变型和RAS野生型MTC患者中，这些基因的表达水平没有差别[11]。

与正常甲状腺组织相比，miRNA在甲状腺癌组织中过表达或表达下调。在PTC组织中，miRNA-940、miRNA-15a、miRNA-16和 let-7b表达下调[12-13]；在FTC组织中，miRNA-663b、miRNA-137、miRNA-30c-1、miRNA-767-5p和miRNA-603过表达，miRNA-7、miRNA-1179、miRNA-7-2、miRNA-486-5p和miRNA-130b表达下调[14]；在ATC组织中，miRNA-125b、miRNA-148b-3p、miRNA-141-3p、miRNA-135a-5p和miRNA-19a-3p表达下调[15-16]；在MTC组织中，miRNA-21、miRNA-183和miRNA-375表达上调[17]。这些结果表明，miRNA表达失调与特定类型的甲状腺癌有关。

2 生物样本中miRNA的检测

生物样本中miRNA的表达模式含有丰富的信息，分析这些模式的变化可以为了解不同细胞的生理和病理改变过程提供重要线索[18]。许多疾病的发生都与相关组织中miRNA表达谱的改变有关，而且这种改变已在多种肿瘤中报道[19]。miRNA可以从多种生物样本中分离得到，如细针穿刺活检标本、冷冻组织块、石蜡包埋切片、血清或血浆，且在这些样本中具有很好的稳定性。目前，常用的抽提方法包括化学法（如异丙醇沉淀）和过柱法，化学法的得率高但存在化学污染物，过柱法可以获得高纯度的RNA，但针对不同的样品需要使用特定的提取试剂盒，将抽提获得的RNA进行miRNA定量，随后进行miRNA表达谱分析。常用的miRNA表达谱分析技术有表达芯片（microarray）、定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）、高转录组测序（RNA-seq）和数字聚合酶链反应（digital polymerase chain reaction，dPCR）（表1）。

表1 不同miRNA检测技术的特点

3 miRNA用于甲状腺癌的诊断

3.1 细针穿刺活检和组织标本的miRNA分析

甲状腺结节是最常见的甲状腺疾病，在普通人群中，约50%具有超声可测量的结节，在这些甲状腺结节中，恶性的比例仅为5%[20]，因此术前鉴别甲状腺结节的良恶性至关重要，然而应用传统的细针穿刺活检和细胞学检查进行鉴别的成功率有限。目前，多项研究致力于构建特定的miRNA诊断试剂盒，用于提高甲状腺良恶性结节的诊断特异度和灵敏度。Nikiforova等[21]检测了各种类型甲状腺癌的miRNA表达谱，提出一组可以用于区分不同甲状腺癌的miRNA，包括miRNA-146b、miRNA-155、miRNA-187、miRNA-197、miRNA-221、miRNA-222和miRNA-224。在62个细针穿刺活检标本中，对这些选定的miRNA进行定量分析发现，当其中至少一种miRNA的表达上调2倍以上时，肿瘤检测的灵敏度可达100%，而其特异度和准确度分别为94%和95%；当其中3个以上的miRNA表达上调时，肿瘤检测的特异度可达100%，准确度提高到98%。进一步使用该组miRNA对141例细针穿刺活检标本进行评估，结果显示基于miRNA-146b、miRNA-155和miRNA-221表达的决策模型得到的阳性验证率高达97.7%（其中59%的结节性质在细胞学水平不能判定），且可靠度达78.4%[22]。

3.2 循环miRNA分析

甲状腺癌患者中特异性表达失调的miRNA会分泌进入血液循环，使其可能成为一种非侵入性的肿瘤标志物。一项研究分析了血液循环中已应用于临床检测的miRNA-146b、miRNA-155、miRNA-221和miRNA-222的表达水平，结果发现，与良性对照组相比，PTC组中miRNA-146b和miRNA-155的表达水平更高；miRNA-146b检测PTC的灵敏度和特异度分别为61.4%和57.9%，miRNA-155检测PTC的灵敏度和特异度分别为74.3%和63.2%；同时还发现miRNA-146b、miRNA-155和miRNA-222的表达水平与肿瘤大小呈正相关[23]。Rosignolo等[24]检测了11例甲状腺癌患者术前及术后30天的血液样本，结果发现，与20例健康对照者比较，甲状腺癌患者术后的miRNA-146a-5p和miRNA-221-3p表达水平显著升高。另有研究报道，FTC患者血浆中的miRNA-21表达水平高于甲状腺良性结节患者或PTC患者[25]。另一项关于血浆miRNA表达谱的分析结果显示，与甲状腺良性结节患者或健康者比较，PTC患者的miRNA-25-3p和miRNA-451a表达水平显著升高，且采用这两种miRNA鉴别PTC和甲状腺良性结节时，灵敏度分别为92.8%和88.9%，特异度分别为68.8%和66.7%[26]。与此相反，有研究发现甲状腺癌患者的miRNA-451表达水平下调[27]。更重要的是，miRNA-451已经明确与溶血相关，因此将其作为循环性标志物存在一定困难[28]。尽管如此，仍有研究表明，虽然甲状腺癌组织中miRNA-145的表达水平较低，但血清和细针穿刺活检标本中的miRNA-145可用于诊断甲状腺癌[29]。

4 miRNA作为甲状腺癌的预后标志物

miRNA的表达也有可能作为判断甲状腺癌患者临床结局的一个预后因素。虽然PTC患者的病死率相对较低，但20%的患者会发生淋巴结和远处转移，导致患者的远期结局恶化[30]。应用灵敏度高的生物标志物可以筛选这些患者，对其健康状况进行监控并进行及时治疗。研究显示，发生淋巴结转移的甲状腺癌患者的miRNA-221、miRNA-21、miRNA-146a和miRNA-146b表达水平显著升高[31-33]。miRNA-146b过表达的甲状腺癌患者总体生存率明显低于miRNA-146b表达水平较低的患者，miRNA-146b过表达可显著提高肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并使肿瘤细胞对化疗诱导的细胞凋亡产生耐药性[34]。研究还发现，miRNA-146a、miRNA-146b和miRNA-221的表达水平与甲状腺癌患者的TNM分期呈正相关[35-36]。对于PTC患者，miRNA-146b的过表达会促进细胞增殖，增加复发风险[37]。在PTC患者中，miRNA-146b-5p表达显著升高，而这种现象在其他类型的甲状腺癌组织中是不存在的，提示miRNA-146b-5p可以作为PTC诊断和预后评估的标志物[38]。miRNA-21和miRNA-9与肿瘤细胞的转移潜能相关，可以较好地预测淋巴结转移；miRNA-181a-2-3p和miRNA-99b-3p可用于预测滤泡型甲状腺乳头状癌患者的无复发生存期，对诊断和预后预测具有潜在的应用价值[39]。这些研究结果表明，miRNA具有作为生物标志物的潜能，可非侵入式监测甲状腺的状态和甲状腺癌的复发。

5 miRNA作为甲状腺癌治疗的潜在靶点

miRNA在肿瘤发病机制中发挥重要作用。研究发现，miRNA及其加工复合体直接参与上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）和p120连环蛋白介导的细胞黏附[40]。与遗传改变不同，miRNA表达的变化可以被调整，因此肿瘤患者中miRNA表达水平的显著失调是一个潜在的治疗靶点。针对上调的miRNA，可以使用特异性的抑制剂或体外合成其反义miRNA调整其生物学效应。对于低表达水平的miRNA，可以导入人工合成的成熟miRNA分子直接使其表达上调，也可以导入质粒表达的初始miRNA分子或前体分子。有研究证实，在使用恢复miRNA-150表达的甲状腺癌细胞系构建的小鼠模型中，肿瘤细胞的增殖被显著抑制[41]。小鼠模型的研究肯定了miRNA靶向治疗的潜在应用价值，然而要直接进入临床试验还有很多问题亟待解决。

6 小结与展望

miRNA表达失调在甲状腺癌的发生过程中至关重要，其作为甲状腺癌的诊治和预后评估标志物具有潜在的应用价值，特异性miRNA的检测可以明显提高甲状腺癌诊断的灵敏度和准确度，目前尚未见到将miRNA应用于甲状腺癌治疗的临床报道，然而大量的功能性研究和临床前研究已经揭示了miRNA用于甲状腺癌诊断和治疗的巨大潜在价值。甲状腺癌患者中的miRNA具有显著的肿瘤抑制效应，其作用并不局限于调控甲状腺癌细胞的生长，在辅助治疗时也能发挥作用。对于临床前研究，关注点大部分聚焦在PTC上，各科研工作者使用当前常用的小鼠动物模型，经体外实验获取PTC中miRNA的调整数据，为临床前研究提供了理论基础。除了PTC这一亚型，关于其他亚型如FTC和PDTC中miRNA功能的研究较少。

循环miRNA是甲状腺癌早期诊断、监测和治疗的理想分子标志物。与循环mRNA相比，循环miRNA更加稳定，并具有组织特异性，因此是一种更有价值的生物标志物。如果能够改良miRNA的定量方法，确定循环miRNA的标准化定量，预期未来这一生物标志物将会广泛应用于甲状腺癌患者的早期诊断和个体化治疗。