高效液相色谱法测定痛风定胶囊中落新妇苷的含量

薛嘉盛，曲健源，王婧芸，毛明清，金铭昭，房丽娜

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业学生，辽宁 沈阳 110034；2.医学检验技术专业学生；3.内科学专业研究生；4.基础医学院药理学教研室）

痛风定胶囊由秦艽、黄柏、延胡索、赤芍、川牛膝、泽泻、车前子、土茯苓8味药材组成，具有清热祛湿、活血通络定痛的功效。用于湿热瘀阻所致的痹痛，症见关节红肿热痛，伴有发热、汗出不解、口渴心烦、小便黄、舌红苔黄腻、脉滑数，临床常用于治疗痛风发作［1-3］。《中国药典》2015年版一部规定，采用高效液相色谱（HPLC）法测定该品种中黄柏、秦艽两味药材中有效成分的含量，并采用薄层色谱法对延胡索、赤芍两味药材进行鉴别。然而，没有对土茯苓等其他药材中的有效成分进行含量控制。落新妇苷为土茯苓中的有效成分，具有抗炎、镇痛等药理作用［4-6］。本研究采用HPLC法测定该品种中土茯苓的有效成分落新妇苷的含量，为完善痛风定胶囊的质量控制方法提供依据。

1 材料

1．1 仪器 高效液相色谱仪（日本日立公司），配备二元高压梯度泵（L-2130）、紫外检测器（L-2400）、自动进样器（L-2200）和工作站；Venusil ASB C18色谱柱（250 mm ×4．6 mm，5μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；XSE105型电子分析天平（瑞士梅特勒托利多集团）；KQ3200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Spectra Max190光吸收酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1．2 药品与试剂 落新妇苷对照品（批号：S0907AS）购自大连美仑生物技术有限公司，纯度（99．8%，HPLC）。痛风定胶囊购自四川升和药业股份有限公司（批号：1803102）。甲醇（美国Sigma-Aldrich公司）、甲酸（天津市科欧密化学试剂有限公司）均为色谱纯。水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 采用C18色谱柱（250 mm×4．6 mm，5μm），甲醇 -1%甲酸水（V∶V=38∶62）为流动相，流速 1．0 ml/min，检测波长 300 nm，柱温30℃，进样量10μl。在上述色谱条件下，落新妇苷的理论塔板数不少于4 000。色谱图见图1。

图1 落新妇苷的HPLC图

2．2 溶液的制备

2．2．1 对照品溶液的制备 取落新妇苷对照品约10 mg，精密称定，置于10 ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，得浓度为1．003 mg/ml的对照品储备液。精密量取对照品储备液0．5 ml，置于10 ml容量瓶，得浓度为5．015μg/ml的对照品溶液。

2．2．2 供试品溶液 取痛风定胶囊20粒，取出内容物研细，混匀，取内容物约0．5 g，精密称定，置于50 ml容量瓶中，加入50%甲醇溶液40 ml，超声提取20 min（频率40 kHz，功率75 W），放置至室温后，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，过滤（0．45 μm微孔滤膜），取续滤液作为供试品溶液。

表1 回收率试验结果

2．3 定量限与检测限 取对照品溶液适量，用50%甲醇逐步稀释，按上述色谱条件进样测定，结果落新妇苷的定量限为2．5 ng（信噪比S/N=10），检测限为1 ng（S/N=3）。

2．4 线性与范围 取落新妇苷对照品溶液，分别进样 2、6、10、14、16、18、20 μl，将进样量 X（ng）与峰面积Y进行线性回归，得回归方程为Y=581 2．0X-783 6．1，相关系数（R2）＞0．999 9。结果表明落新妇苷在 10．03～100．3 ng/ml范围内，线性关系良好。

2．5 精密度试验 精密吸取落新妇苷对照品溶液10μl，在2．1项下色谱条件下连续进样6次，测定落新妇苷的峰面积。结果落新妇苷峰面积的RSD为1．02%，表明仪器的精密度良好。

2．6 重复性试验 取痛风定胶囊内容物粉末6份，每份约 0．5 g，精密称定，按照 2．2．2 项下制备方法制备供试品溶液，按2．1项下的色谱条件进行测定，计算含量。结果落新妇苷的含量平均值为0．852 9 mg/g，RSD为1．37%，表明方法的重复性良好。

2．7 稳定性试验 取痛风定胶囊1份，制备供试品溶液后于室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h后按2．1项下的色谱条件进行测定，以落新妇苷峰面积计，RSD为2．48%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

2．8 回收率试验 取已知含量的痛风定胶囊约0．25 g，共6份，精密称定，分别加入对照品溶液（含落新妇苷对照品 0．200 6 mg）适量，按 2．2．2 项下方法制备供试品溶液，按2．1项下的色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表1。落新妇苷的平均加样回收率为100．3%，RSD为1．68%，表明方法的回收率良好。

2．9 样品含量测定 取痛风定胶囊约0．5 g，共3份，按2．2．2项下方法制备供试品溶液，按2．1项下的色谱条件进行测定，以外标法计算含量，结果，痛风定胶囊中含有落新妇苷0．354 4 mg/粒。

3 讨论

3．1 检测波长的选择 取落新妇苷对照品溶液进行全波长扫描，在200～600 nm范围内，落新妇苷在300 nm波长下有较大的吸收，因此选择300 nm作为测定波长。

3．2 色谱条件的选择 本研究对流动相系统（甲醇-水和乙腈-水系统）进行考察，并考察了甲酸的浓度对落新妇苷色谱峰峰形的影响。结果甲醇-0．1%甲酸水作为流动相，可以获得满意的色谱峰峰形。在该流动相条件下，甲醇与0．1%甲酸水的体积比为37∶63、38∶62、40∶60时，落新妇苷色谱峰均能与其他色谱峰分离。柱温为30℃时落新妇苷与相邻色谱峰的分离度比柱温为35℃时更大，因此，最终选择甲醇-0．1%甲酸水（38∶62），柱温30℃为色谱条件。

3．3 供试品溶液制备方法的选择 采用单因素轮换法，比较了以水、50%甲醇、90%甲醇作为溶剂，超声10 min、20 min、30 min提取痛风定胶囊中落新妇苷的方法，结果50%甲醇，超声提取20 min和30 min时，提取效率最高。最终选择以50%甲醇作为溶剂，超声提取20 min作为供试品制备方法。

综上所述，本研究所建立的HPLC方法操作简单，线性、精密度、重复性、稳定性、回收率良好，能准确测定痛风定胶囊总落新妇苷的含量，可作为控制该产品质量的方法。由于痛风定胶囊是保密配方，无法获得其处方组成和生产工艺，导致无法制备阴性样品，因此无法进行专属性研究。