氯化两面针碱减轻糖尿病肾病模型大鼠的肾脏损伤

刘树根，李泽玲，罗新辉，魏桂林*

(1.泉州罗裳制药厂 药物研究中心，福建 泉州 362000；2.赣南医学院第一附属医院 药剂科，江西 赣州 341000)

近年来由于生活方式的改变，中国糖尿病患病率高达11.6%，位居全球之首[1]。其中约有30%～40%的2型糖尿病患者随着病情进展进入临床肾病阶段，其中约20%患者逐渐发展为间质纤维化，最终进展为慢性肾功能衰竭，约50%患者在5年内死亡。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的微血管并发症，是最严重的并发症之一，由于起病隐匿，早期无明显临床症状，但随病情发展与病变程度加剧，是导致终末期肾病和患者死亡的主要原因[2- 3]。糖尿病肾病主要表现肾小球肥大，基底膜增厚，逐渐发展为间质纤维化，最终进展为慢性肾功能衰竭。但具体的发病机制尚未明确，尚未有特效的治疗，因此需要对其发病机制进行深入研究。

氯化两面针碱(nitidine chloride，NC)是从天然植物两面针的干燥根中提取的生物碱，既往对氯化两面针碱的研究主要是在抗肿瘤活性方面[4]。研究发现，氯化两面针碱对黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞及前列腺细胞的增殖具有抑制作用，但其抗肿瘤活性弱于喜树碱及其衍生物[5]。到目前为止尚未有文献提出氯化两面针碱对糖尿病肾病的治疗作用。本研究首次采用氯化两面针碱对糖尿病肾病大鼠进行干预，从而观察氯化两面针碱对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用，并探讨其初步的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级SD大鼠，雄性，8～10周龄，体质量180～220 g [郑州大学医学院动物实验中心，合格证号：SYXK(豫)2013- 0006]，进行适应性喂养1周后开展实验。

1.1.2 实验材料：高糖高脂饲料由动物实验中心配制，成分：基础饲料63.5%、猪油8%、蛋黄粉10%、蔗糖18%、胆酸钠0.5%；链脲佐菌素(Sigma-Aldrich公司)；考马斯亮蓝染色试剂盒(江苏碧云天生物研究所)；Albumin尿白蛋白(大鼠) 放射免疫试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)；氯化两面针碱(nitidine chloride, NC)(淡黄色针状结晶，纯度>98%，成都普思生物科技有限公司，生产批号：20150413)；TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3与Smad7的抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及处理：将大鼠分为对照组(control)和糖尿病肾病组(DN组)。采用高糖高脂饲料喂养6周后，禁食过夜，次日采用链脲佐菌素腹腔单剂量注射，35 mg/kg，注射完毕，继续采用高糖高脂饲料喂养，正常饮水。72 h后尾静脉取血测定空腹血糖值(FBG)，FBG值大于16.7 mmol/L、尿量大于原尿量50%且尿蛋白(UPro)排泄率大于30 mg/24 h为糖尿病肾病模型造模成功；NC- 20和40 mg/kg干预组，灌胃氯化两面针碱，1次/d，共7周。

1.2.2 样本收集：实验结束前1 d，收集24 h尿液；收集血清；麻醉大鼠，摘取左右肾脏，备用。

1.2.3 尿液生化指标测定： 用考马斯亮蓝染色试剂盒检测24 h尿蛋白(UPro)含量；用albumin尿白蛋白(大鼠) 放射免疫试剂盒测定尿白蛋白(UAlb)含量。

1.2.4 血清生化指标测定：用7150全自动生化分析仪检测血尿素氮(BUN)和血肌酐(SCr)含量。

1.2.5 过碘酸希夫(PAS)染色法：将肾脏组织制作成石蜡固定切片，常规脱蜡至水，蒸馏水洗涤2 min，过碘酸氧化液浸洗约10～20 min，蒸馏水洗涤2 min，置于Schiff液中染色20 min，蒸馏水冲洗5 min，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片晾干，置于显微镜下观察。

1.2.6 血清中胰岛素与胰高血糖素含量水平的检测：用试剂盒检测各组大鼠血清中的胰岛素与胰高血糖素。胰岛素结果以胰岛素μIU/mL血清，胰高血糖素以胰高血糖素pg/mL血清表示。

1.2.7 原位末端标记法检测肾小球细胞凋亡：将石蜡切片常规脱蜡至水，5%过碘酸室温孵育1～2 min，PBS漂洗3次，加入20 μg/mL蛋白酶K工作液，37 ℃反应20 min，4%多聚甲醛固定5 min，加入100 μL平衡液10 min，滴加Tunel反应液，并于湿盒中避光反应30 min， PBS漂洗3次，滴入DAPI染液，孵育15 min，封片。将切片置于显微镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒为凋亡细胞。

1.2.8 免疫印迹法检测：将100 mg肾脏组织样本冰上剪碎，加入预冷的RIPA裂解液，冰上匀浆，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清液进行蛋白定量，进行SDS-PAGE电泳，电泳完成后，转移至硝酸纤维素膜，加入封闭液中室温孵育1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤2次，加入相应二抗室温孵育1 h，TBST洗涤2次，化学发光法显色，将将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统分析目标条带。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 氯化两面针碱对糖尿病肾病大鼠尿液生化指标和血清生化指标的影响

与对照组相比，糖尿病肾病组大鼠24 h尿蛋白(UPro)、尿白蛋白(UAlb)、血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)含量均升高(P<0.05)；与糖尿病肾病组大鼠相比，给予氯化两面针碱干预后，大鼠24 h尿蛋白(UPro)、尿白蛋白(UAlb)、血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)含量均降低(P<0.05)，与药物剂量相关(图1)。

2.2 氯化两面针碱对糖尿病肾病大鼠胰岛素和胰高血糖素含量的影响

与对照组相比，糖尿病肾病组大鼠血清中胰岛素的含量降低(P<0.05)，胰高血糖素的含量升高(P<0.05)；与糖尿病肾病组大鼠相比，给予氯化两面针碱干预后，大鼠血清中的胰岛素含量升高(P<0.05)，胰高血糖素含量降低(P<0.05)，与药物剂量相关(图2)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with DN group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with DN group图2 氯化两面针碱对糖尿病肾病大鼠胰岛素和胰高血糖素含量的影响

2.3 各组大鼠肾脏组织病理形态学变化

对照组大鼠的肾脏组织未出现明显病理变化；糖尿病肾病组大鼠的肾小叶中央可见PAS染色阳性物质，基底膜增厚，系膜基质增多，肾小球呈现弥漫性病变；给予氯化两面针碱干预后，肾脏的PAS染色呈弱阳性，可见弥漫性肾小球硬化，高剂量组无基底膜增厚及肾小管病变(图3)。

图3 各组大鼠肾脏组织病理形态学变化Fig 3 Pathological changes of kidney in each group(×200)

2.4 各组大鼠肾小球细胞凋亡的变化

对照组大鼠肾小球细胞未出现凋亡；糖尿病肾病组大鼠肾小球细胞凋亡明显；与糖尿病肾病组相比，给氯化两面针碱干预后，大鼠肾小球细胞凋亡数明显减少，并随药物剂量增大而细胞凋亡数逐渐减少(图4)。

2.5 各组大鼠肾组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3与Smad7蛋白表达的变化

与对照组相比，糖尿病肾病组大鼠肾组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3与Smad7的蛋白表达增加(P<0.05)；与糖尿病肾病组相比，给氯化两面针碱干预后，NC- 20 mg/kg和40 mg/kg组大鼠肾组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3与Smad7的蛋白表达下降(P<0.05)，Smad2与Smad3蛋白表达无显著变化(图5，6)。

3 讨论

DN发病机制主要涉及肾组织反复损伤、修复和纤维化。DN肾组织在长期高糖刺激下，TGF-β/Smad信号通路被激活，进而进一步促进DN肾组织的纤维化进展[6]。而转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)在DN纤维化TGF-β/Smad信号中处于中心地位[7]。本研究发现，模型组TGF-β1的蛋白表达升高，给予氯化两面针碱干预后，TGF-β1的蛋白表达降低。活化的TGF-βRI磷酸化后，激活Smad2和Smad3蛋白被磷酸化，然后与Smad4结合形成异三聚体并转入核内，介导上皮细胞-间充质转换、肾细胞凋亡等，最终导致肾小球硬化及肾间质纤维化[8]。而Smad7是TGF-β/Smad通路中的一个负反馈抑制剂，能够干扰Smad2与Smad3的磷酸化而抑制其传导[9]。研究发现当TGF-β/Smad信号通路处于高度激活状态，肾脏系膜细胞、肾小管上皮细胞和血管平滑肌细胞中的胶原合成显著增加，形成肾间质纤维化，并出现Smad7功能的缺失[10]。实验结果显示，在采用氯化两面针碱干预后，TGF-β的蛋白表达下调，Smad2与Smad3磷酸化水平明显低于未干预前，此外，Smad7的蛋白表达下调，推测是氯化两面针碱可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路，从而降低肾脏组织胶原合成，降低肾间质纤维化，起到保护肾脏的作用。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with DN group图4 氯化两面针碱对各组大鼠肾小球细胞凋亡的影响Fig 4 The effect of nitidine chloride on the apoptosis of glomerular cells in each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with DN group图5 各组大鼠肾组织中p-Smad2与p-Smad3蛋白表达的变化Fig 5 The change of protein expression of p-Smad2 and p-Smad3 in kidney

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with DN group图6 各组大鼠肾组织中TGF-β1与Smad7蛋白表达的变化Fig 6 The change of protein expression of TGF-β1 and Smad7 in kidney

综上所述，本实验通过氯化两面针碱对糖尿病肾病大鼠的基础研究，发现氯化两面针碱对糖尿病肾病大鼠的肾脏具有保护作用，其可能的作用机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路。