杨梅素联合围脂滴蛋白基因沉默促进前脂肪细胞系3T3-L1的降脂

张少华，王君实，董维鹏，燕 炯

(山西医科大学 公共卫生学院 营养与食品卫生学教研室，山西 太原 030001)

脂滴是脂肪细胞中重要的一种细胞器，脂代谢紊乱会造成脂肪堆积，进而导致肥胖的发生[1]。围脂滴蛋白(perilipin 1, PLIN1)作为脂滴表面蛋白重要的一员，在脂肪分解代谢起屏障保护作用[2]。目前认为，调控脂肪分解的经典通路是环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)信号通路(简称cAMP/PKA通路)，激活该通路可以使PLIN1和HSL磷酸化，促进脂解的进行[3]。

蛋白激酶C(PKC)-丝裂原活化细胞外调节信号激酶(mitogen activated extracellular signal regulated kinase, MEK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)信号通路(简称PKC-MEK/ERK通路)也可对脂解作用进行调节，该通路激活后可磷酸化激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL)，进而促进脂肪分解，而肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α以及杨梅素(myricetin, Myric)均通过该条通路引发促脂解作用[4]。

本实验拟通过沉默PLIN1与杨梅素联合干预的方法，观察脂解通路相关指标的变化，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：3T3-L1前脂肪细胞系(Boster生物工程公司)。

1.1.2 试剂：Lipofectamine® LTX & Plus Reagent(Invitrogen公司)；杨梅素(上海阿拉丁试剂有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM/F12细胞培养基、胰蛋白酶溶液、青链霉素混合液和羊抗兔二抗(Boster生物工程公司)；p-HSL、ERK1/2、p-ERK1/2、MEK和p-MEK抗体(CST公司)；cAMP、PKA和p-PKC小鼠ELISA试剂盒(上海西塘科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：将3T3-L1前细胞接种于含10% FBS的DMEM/F12培养基中，取处于对数增殖期的细胞接种于6孔板中。采用经典“鸡尾酒”方法对细胞进行诱导分化为成熟的脂肪细胞[5]。在细胞汇合到80%左右时，将培养基换成诱导分化培养基Ⅰ，2 d之后换为诱导分化培养基Ⅱ继续培养2 d，随后更换为基础培养基，每2 d换液1次，诱导分化为成熟脂肪细胞，成功后进行后续操作。

杨梅素联合sh-RNA重组干扰载体进行干预实验。随机分为对照组、sh-RNA组、Myric组和Myric+sh-RNA组。杨梅素干预条件的筛选实验结果显示，杨梅素在干预浓度和干预时间分别为100 μmol/L和72 h时脂解效果最明显。本课题组前期已构建PLIN1的sh-RNA干扰载体，并已成功验证其可有效促进脂肪细胞的脂解作用，根据本课题组前期优化后的细胞转染条件进行操作[6]。将5 μg质粒与10 μL脂质体混匀，转染进脂肪细胞。转染6 h后，Myric组和Myric+sh-RNA组换成含有Myric(100 μmol/L)的培养基干预72 h，其余两组换成正常培养基。

1.2.2 脂滴油红O染色：每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，室温下静置2 h。弃掉溶液，加入油红O工作液(现配现用)。1 h后，冲洗2遍，在显微镜下观察并拍照。

1.2.3 Western blot检测各组蛋白含量：干预结束后，每孔加入200 μL含PMSF和磷酸化蛋白酶抑制剂的细胞总蛋白裂解液，提取各组蛋白，用BCA法测定各组蛋白浓度，并调平浓度。制备凝胶，每个泳道加50 μg待测样品，浓缩胶80 V恒压电泳，分离胶120 V恒压电泳后，220 mA恒定电流进行湿式转膜法转膜。转膜结束后，封闭2 h。用封闭液稀释的一抗进行反应，4 ℃过夜。二抗孵育时37 ℃振摇70 min。取出条带，加入ECL发光工作液，暗盒暗室曝光。ImageJ软件对目的蛋白条带进行分析并测定吸光度值，以β-actin进行校正。

1.2.4 ELISA测定细胞中cAMP、PKA和p-PKC含量：严格按照双抗体夹心ABC-ELISA试剂盒说明书进行操作，在450 nm波长处测定吸光度(A)值，绘制标准曲线，计算待测样品浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 杨梅素与sh-RNA干扰载体对脂滴形态及分布的影响

油红O染色后，对照组脂滴颜色深，大脂滴分布最多；sh-RNA组和Myric组脂滴呈“戒环样”结构围绕细胞核，颜色变浅，脂滴变小；Myric+sh-RNA组镜下显示脂滴数量进一步减少，大脂滴数量明显减少(图1)。

2.2 杨梅素与sh-RNA干扰载体对cAMP/PKA信号通路的影响

Myric+sh-RNA组和Myric组的cAMP 和PKA含量较对照组降低(P<0.05)(表1)。Myric+sh-RNA组和Myric组的p-HSL蛋白表达量高于sh-RNA组和对照组(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with sh-RNA group图2 各组中p-HSL蛋白的表达Fig 2 Expression of p-HSL protein in each group

groupcAMP(pmol/mg protein)PKA(ng/mg protein)control 355±14 1.533±0.088sh-RNA 389±28 1.703±0.072Myric 282±18*△ 1.010±0.019*△Myric+sh-RNA 284±60*△ 1.151±0.097*△

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with sh-RNA group.

2.3 杨梅素与sh-RNA干扰载体对PKC-MEK/ERK信号通路的影响

2.3.1 杨梅素与sh-RNA干扰载体对p-PKC含量的影响：Myric+sh-RNA组和Myric组p-PKC含量较其余两组含量升高(P<0.05)(表2)。

表2 p-PKC浓度的测定Table 2 Concentration of n=6)

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with sh-RNA group.

2.3.2 杨梅素与sh-RNA干扰载体对p-MEK/MEK及p-ERK/ERK比值的影响：Myric+sh-RNA组和Myric组较其他两组的p-MEK和p-ERK蛋白表达含量升高(P<0.05)(图3)。

3 讨论

cAMP/PKA信号通路是调节脂肪分解的经典通路。当儿茶酚胺类激素存在时，可与细胞膜上的β-肾上腺素受体相结合，刺激G蛋白与腺苷酸环化酶结合激活腺苷酸环化酶，催化cAMP表达，cAMP作为第二信使可激活PKA，进而磷酸化HSL和PLIN1[7]。有报道磷酸化的HSL(p-HSL)酶活性较HSL增加约100%[8]。磷酸化的PLIN1结构发生变化，与CGI-58分离并移出脂滴表面，对脂滴失去屏障保护作用，更多的p-HSL移位至脂滴表面，发挥其水解作用；同时CGI-58游离于细胞质中，与ATGL相结合并激活其脂解作用。

近年来，PKC-MEK/ERK信号通路是调控脂解的热点研究通路。对TNF-α的研究发现，其对cAMP/PKA没有影响，却可通过激活PKC-MEK/ERK信号通路来发挥促脂解的作用[9]。当TNF-α以及杨梅素等促脂解因子存在时，可激活PKC，促使PKC磷酸化，进而激活p-MEK，p-MEK又可激活p-ERK，p-ERK进一步促使HSL的磷酸化，从而发挥促进脂肪分解[10-11]。但也有报道显示，PKC-MEK/ERK信号通路激活后只磷酸化HSL，而对PLIN1没有磷酸化作用[12]。

本实验结果显示，联合干预组和杨梅素组cAMP和PKA表达含量均明显低于转染组和对照组，并且sh-RNA组和对照组表达无差别。这说明PLIN1基因沉默对上游cAMP/PKA信号通路没有影响，而杨梅素则对该通路中相关因子的活性起一定的抑制作用。联合干预组和杨梅素组p-PKC、p-MEK、p-ERK以及p-HSL蛋白表达量均显著高于转染组和对照组,提示杨梅素的促脂解作用主要是通过激活PKC-MEK/ERK信号通路，增加p-HSL的表达量来实现的，而沉默PLIN1对该通路无影响。

本次实验主要探讨了PLIN1沉默与杨梅素作用对脂解通路上的影响，为进一步了解其生物功能及今后肥胖症的防治提供了实验基础。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with sh-RNA group图3 各组对MEK/ERK信号通路的影响Fig 3 Effect of myricetin and PLIN1 on PKC-MEK/ERK signaling n=3)