硼替佐米促进霍奇金淋巴瘤细胞系L428的凋亡

陈宛丽，关红梅，王 舒

(南阳市第二人民医院 血液科, 河南 南阳 473000)

霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)为淋巴系统的恶性实体瘤之一[1]，其特征是瘤组织内含有特异性的R-S(Reed-Sternberg)细胞，并常伴有多量炎性细胞反应[2]。尽管部分霍奇金淋巴瘤治愈率高，但仍存在一些难治性患者，需要使用其他药物来治疗这些患者。

硼替佐米(Bortezomib)是哺乳动物细胞中26S蛋白酶体可逆抑制剂，主要用于多发性骨髓瘤的治疗[3]，也用于非霍奇金淋巴瘤的治疗[4]，但是用于霍奇金淋巴瘤的治疗报道较少。本研究通过探究不同剂量硼替佐米对细胞系L428形态、细胞凋亡的影响，并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

经典型霍奇金淋巴瘤细胞系L428(武汉普诺赛细胞库)；硼替佐米(西安杨森制药有限公司)；MTT细胞活力试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、Hoechst33258试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒(江苏碧云天生物有限公司)；Bax、Bcl-2、cleaved casepase-3、β-actin抗体(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理：将霍奇金淋巴瘤细胞系L428培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。将细胞分为对照组(control)和不同浓度硼替佐米组(分别给予10、30和50 nmol/L硼替佐米处理24 h)。

1.2.2 MTT检测细胞活力：将L428细胞以5×103个/mL铺于96孔板上，用硼替佐米处理后，按照说明书进行MTT实验，并在酶标仪540 nm处读取各孔的吸光值(A)。

1.2.3 倒置显微镜下观察细胞形态：将L428细胞以5×103个/mL铺于96孔板上，用10 nmol/L硼替佐米处理24 h后，倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.4 Hoechst33258染核：将L428细胞5×103个/mL铺于在96孔板中，用硼替佐米处理后，按照说明书进行Hoechst33258染核操作，荧光显微镜下检测，检测条件激发光波长为380 nm，发射波长为420 nm。

1.2.5 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡：将L428细胞5×103个/mL铺于在96孔板中，用硼替佐米处理后，按照说明书进行TUNEL染色操作，并在荧光酶标仪激发波长450 nm和发射波长565 nm处读取各孔的荧光值，并根据说明书计算TUNEL阳性细胞数。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡：将L428细胞以5×105个/mL接种于24孔板中，用硼替佐米处理后，收集细胞；按照说明书进行Annexin V-FITC/PI进行染色操作，进行流式细胞仪上机检测，检测条件激发光波长为488 nm，发射波长为530 nm。

1.2.7 Western blot检测蛋白水平：冰上萃取蛋白，调整蛋白浓度进行SDS-PAGE电泳。电转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭40 min，室温孵育一抗Bax、Bcl-2和cleaved casepase-3(1∶2 000稀释) 2 h，洗膜3次，室温孵育相应二抗(1∶2 000稀释) 1 h，洗膜3次。自动显影仪显影，并采用Image J分析条带吸光值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 硼替佐米对L428细胞形态学的影响

与对照组相比，加入10 nmol/L硼替佐米培养24 h后，L428细胞出现拉丝、稀疏现象(图1A)；硼替佐米处理后的细胞核出现不同程度的固缩，出现凋亡的荧光小体(图1B)。

2.2 硼替佐米对L428细胞活力的影响

与对照组相比，硼替佐米浓度依赖性抑制L428细胞活力(P<0.05)(图2)。

2.3 硼替佐米对L428细胞凋亡的影响

与对照组相比，硼替佐米浓度依赖性促进L428细胞凋亡(P<0.05)(图3)。

2.4 硼替佐米对L428细胞cleaved caspase-3蛋白表达的影响

加入硼替佐米培养L428细胞后，cleaved caspase-3蛋白水平呈浓度依赖性上调(P<0.05)(图4)。

A.L428 cell morphology of inverted microscope; B.Nuclear morphology of Hoechst33258 staining图1 硼替佐米对L428细胞形态学的影响Fig 1 Effect of Bortezomib on L428 cell morphology

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with 10 nmol/L; △P<0.05 compared with 30 nmol/L图2 硼替佐米浓度依赖性抑制L428细胞活力Fig 2 Bortezomib inhibited L428 cell viability in a dose-

2.5 硼替佐米对L428细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

加入硼替佐米培养L428细胞后，Bcl-2蛋白水平呈浓度依赖性下调(P<0.05)；Bax蛋白水平呈浓度依赖性上调(P<0.05)(图5)。

3 讨论

大部分霍奇金淋巴瘤患者通过常规化疗可以治愈，但仍存在一些复发性患者或者难治性患者[5]，需要使用其他药物来治疗这些患者。文献报道硼替佐米能通过激活线粒体凋亡途径诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡[6]，近来同样发现能诱导非霍奇金淋巴瘤细胞凋亡[7]，但在霍奇金淋巴瘤的治疗报道较少。因此，开发其他药物对霍奇金淋巴瘤治疗具有重大意义。在本实验中，首先用MTT实验发现，硼替佐米能浓度依赖性抑制L428细胞活力，进一步采用Annexin V-FITC/PI染色和TUNEL染色，发现硼替佐米能浓度依赖性诱导L428细胞凋亡。同时Hoechst 33258荧光染色，发现硼替佐米诱导L428细胞凋亡同时出现了细胞核固缩和凋亡小体形成。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程，其中Bcl-2家族在细胞凋亡中起到重大作用[8]。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w等)和促凋亡蛋白(Bax、Bit、Bim等)组成[9]。在凋亡过程中，Bcl-2降解，胞质Bax转位至线粒体膜，增加通透性，释放细胞色素C，最终激活caspase-3诱导细胞凋亡[10-12]。因此，本研究采用Western blot观察了硼替佐米对L428细胞Bcl-2和bax的影响，发现Bcl-2表达下调，Bax上调，且检测到caspase-3的切割片段，故结合以上结果及文献分析，提示硼替佐米可能通过下调Bcl-2蛋白的表达，促进Bax转位，从而引起线粒体外膜通透性增加，caspase-3激活，最终导致细胞凋亡。

A.representative images and statistical analysis of Annexin V-FITC/PI staining; B.statistical analysis of TUNEL staining;*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with 10 nmol/L;△P<0.05 compared with 30 nmol/L

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with 10 nmol/L;△P<0.05 compared with 30 nmol/L

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with 10 nmol/L; △P<0.05 compared with 30 nmol/L图5 Western blot检测硼替佐米对细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响Fig 5 Effect of Bortezomib on the protein expressions of Bcl-2 and Bax detected by Western