阿托伐他汀促进糖尿病大鼠肾组织BMP- 7和SnoN的表达

彭 伟，张小欢，刘玲伶，王圆圆，刘丽荣，石明隽，郭 兵

(贵州医科大学 1.基础医学院 病理生理学教研室； 2.贵州省高校重大疾病发病机制及药物防治特色重点实验室； 3.医学检验学院 临床血液学教研室，贵州 贵阳 550025)

中国是全球糖尿病患者人数最多的国家[1]，糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)作为糖尿病最严重的微血管并发症严重影响到国民的身体健康。转化生长因子β1(transforming growth factor-beta1,TGFβ1)是糖尿病肾脏病变的关键致病因子,TGFβ1/Smads信号通路是肾纤维化的重要信号通路之一[2]。SnoN作为一种核转录共抑制因子，它能在细胞质和细胞核中阻断TGFβ1/Smads信号通路的传导，是该信号通路的重要负调控因子[3]。骨形蛋白- 7(bone morphogenetic protein 7,BMP- 7)已证实可以通过激活多种信号通路来抗肾脏纤维化病变[4]。有研究表明阿托伐他汀对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用[5],但其具体药物机制目前并不清楚。本研究旨在研究阿托伐他汀是否通过影响BMP- 7和SnoN的蛋白表达来减轻或逆转肾脏纤维化病变，从而为阿托伐他汀治疗DN提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：链脲佐菌素(streptozocin, STZ)、ColⅠ和Col Ⅳ抗体(Sigma公司)；SnoN、E-cadherin、Col Ⅲ、BMP- 7及Desmin抗体(Santa Cruze公司)；β-actin抗体(PMK公司)；阿托伐他汀AT(辉瑞制药有限公司)。

1.1.2 动物：SPF级SD雄性大鼠24只，体质量170～200 g[北京华阜生物科技股份有限公司，SCXK(京)2009- 0004]。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及处理：将大鼠分为对照组、DM组和AT治疗组，大鼠饲养4周后，给予阿托伐他汀10 mg/(kg·d)(0.3%羧甲基纤维素作溶媒)灌胃治疗8周。16周后处死大鼠，并进行血、尿及肾组织的采集、生化检测和肾组织形态学的观察。

1.2.2 免疫组化检测：免疫组化SP法检测Col Ⅰ(1∶200)、Col Ⅲ(1∶100)在大鼠肾组织的分布和表达，用PBS作阴性对照，DAB法显色，苏木精复染。用Olypums-DP72显微镜观察并采集图片，用Image-Pro Plus 6.0软件扫描并分析各图累计吸光度值。

1.2.3 Western blot检测：取肾组织皮质部分，加入组织蛋白提取液后匀浆、离心、取上清，用BCA法测定各组蛋白质浓度，取一定量上清液加入加样缓冲液煮沸15 min。上样、电泳、转膜、封闭后,加入BMP- 7、SnoN、E-cadherin、Desmin、Col Ⅳ和β-actin一抗工作液浓度分别为1∶200、1∶200、1∶300、1∶200、1∶1 000、1∶4 000,4 ℃孵育过夜。TBST洗膜5 min×3次，特异性二抗室温孵育1 h后洗膜，ECL显影、曝光。Bio-Rad凝胶成像系统扫描，Image Lab软件分析各条带的面积和吸光度值，两者乘积为积分吸光度值，每个样本重复分析3次。以同一张膜上BMP- 7、SnoN、E-cadherin、Desmin、Col Ⅵ与相应的β-actin条带所测积分吸光度值的比值，即相对积分吸光度值对BMP- 7、SnoN、E-cadherin、Desmin、Col Ⅵ蛋白进行半定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 生化指标

与对照组相比，DM组大鼠血糖、三酰甘油、肾脏指数、尿微量白蛋白/尿肌酐(MA/CR)增多(P<0.05)。AT组大鼠血糖、三酰甘油、肾脏指数、尿微量白蛋白/肌酐较DM组大鼠显著回降(P<0.05)(表1)。

2.2 肾小管间质形态学变化

HE染色可见NC组肾脏结构完整，肾小球结构清晰。DM组大鼠部分肾小管发生扩张，部分肾小管上皮细胞可以见到有空泡样变性，细胞发生萎缩和脱落，肾小管间质细胞增多伴有炎性细胞浸润，而AT组病变明显减轻。肾组织Masson染色显示NC组肾脏结构完整，清晰，肾小管上皮细胞形态饱满，而DM组肾脏结构排列不清，可见肾小球和肾小管的纤维化病变明显，AT组病变明显改善(图1)。

2.3 免疫组化结果

与对照组比较，DM组肾组织Col Ⅰ、Col Ⅲ表达增多，而AT组Col Ⅰ、Col Ⅲ表达相对减少(图2)。

2.4 Western blot结果

与对照组相比，DM组大鼠E-cadherin、BMP- 7和SnoN表达减少(P<0.05)减少，Desmin、Col Ⅳ增多(P<0.05)；AT组 E-cadherin、BMP- 7和SnoN的表达回升，Desmin、Col Ⅳ回降(P<0.05)(图4)。

表1 各组大鼠血糖、三酰甘油、肾脏指数、尿微量白蛋白/尿肌酐(MA/CR)水平

*P<0.05 compared with NC group；#P<0.05 compared with DM group.

图1 各组大鼠肾组织形态学变化Fig 1 Histological change of kidneys in each group rats(×400)

3 讨论

DN是糖尿病重要的微血管并发症，也是终末期肾脏衰竭的重要病因之一。TGFβ1是糖尿病肾脏病变的关键致病因子，在DN的发生发展中，TGFβ1主要介导了肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转换，细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)的沉积引起肾小球的硬化以及肾间质的纤维化[2]。阿托伐他汀是一种降脂药，当用于治疗DN时，除了能够改善糖尿病引起的代谢障碍外[6]，还具有抗纤维化的作用[5]。有少量体内实验研究表明，给予糖尿病大鼠阿托伐他汀治疗时，肾脏纤维化病变明显改善[5- 6]，但是其具体机制尚未明确。

本研究发现，糖尿病状态下SD大鼠肾组织发生了明显纤维化病变，上皮细胞向间充质细胞转换，上皮细胞标志物E-cadherin表达减少，而间充质细胞标志物Desmin表达增加， 细胞外基质蛋白Col Ⅳ表达增加；给予阿托伐他汀治疗后肾脏纤维化的病变得到明显改善。进一步证实了阿托伐他汀具有抗肾脏纤维化的作用，其机制可能是通过上调BMP- 7和SnoN的表达抑制TGFβ1/Smads信号通路。

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with DM group

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with DM group图4 E-cadherin、desmin、Col Ⅳ、BMP- 7和SnoN在各组肾组织中的表达Fig 4 Expressions of E-cadherin, desmin, Col Ⅳ, BMP- 7 and SnoN in kidney tissue in each

BMP- 7是一种35 ku的同型二聚体分泌型糖蛋白，属于TGF-超家族[7]。它能抑制TGF-β1信号通路引起的上皮-间充质细胞转换过程[8]，还能够通过拮抗TGF-β1引起的基质金属蛋白酶2(MMP2)的下调，并且增加阻断该蛋白酶活性的蛋白酶抑制剂PAI- 1的转录和分泌，进而促进细胞外基质的降解来实现抑制ECM沉积的作用[9]。

SnoN是一种核转录共抑制因子，它能在细胞质和细胞核中阻断TGFβ1下游Smads信号通路的传导，是一种重要的负调控因子[10]。在细胞质中，SnoN与Smads蛋白复合体结合，阻止其进入细胞核内，阻断TGFβ1/Smads信号通路的传导。而在细胞核中，SnoN能够破坏Smad2/3与Smad4形成的复合物。还能募集其他核转录共抑制因子与复合物结合，抑制核转录共激活因子而发挥作用[3]。本研究发现，阿托伐他汀治疗后BMP- 7的表达增加，同时SnoN的表达也上调。BMP- 7、SnoN作为肾纤维化病程中的负调控因子，可以通过抑制TGF-β1/Smads信号通路的传导而抑制肾脏纤维化的发生和发展。在高糖培养的肾小管上皮细胞中BMP- 7可以上调SnoN mRNA的表达[11]。因此推测，阿托伐他汀能够通过促进BMP- 7、SnoN的蛋白表达，抑制TGFβ1/Smads信号通路的传导，从而发挥抗肾脏纤维化的作用。