小鼠海马MAM钙信号传导相关蛋白表达的增龄变化

蒋淑君，王 娜，王德华，于延铭

(滨州医学院 1.基础医学院； 2.临床学院， 山东 烟台 264003)

线粒体-内质网结构偶联(mitochondrial-associated endoplasmic reticulum membranes, MAM)是指线粒体外膜与内质网膜之间形成的紧密物理连接[1]。MAM与钙信号调控、脂质合成与运输、线粒体形态功能调控、内质网应激等都有密切联系[2-4]。MAM募集多种与Ca2+信号传导相关的蛋白分子， 形成高浓度的Ca2+微区调控内质网-线粒体间Ca2+转运。MAM区域富含定位于内质网膜的钙释放通道蛋白IP3R(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor)和定位于线粒体外膜的孔蛋白VDAC1(voltage-dependent anion-selective channel protein 1)，两者经分子伴侣GRP75(glucose-regulated protein 75)连接形成IP3R-GRP75-VDAC1复合物， Sigma-1R、FUNDC1、mTOR2和PERK等多种蛋白参与调控，构成促进内质网和线粒体之间钙信号传导通路。兴奋时，Ca2+从内质网被释放到胞质中作为钙信号，线粒体摄取并储存少量Ca2+。Ca2+可以调节线粒体功能，从而影响细胞功能状态；而线粒体对Ca2+摄取也会改变Ca2+信号[5-6]。MAM不仅提供Ca2+转运的平台，而且将线粒体、内质网两个细胞器功能偶联起来，在细胞代谢、生物能学和细胞死亡等多层面上影响细胞生命活动。本实验研究不同年龄小鼠海马MAM中钙信号传导相关蛋白IP3R、GRP75、VDAC1和Sig-1R的表达，探讨神经细胞衰老过程中参与 MAM钙信号传导的关键蛋白，为衰老、神经退行性疾病等研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级C57/BL6J小鼠，雄性，2～24月龄，体质量18～32 g(滨州医学院实验中心动物部，合格证号：SCXK-2016-0011)。组织RNA提取试剂盒(Qiagen公司)，反转录试剂盒(Prime Script公司)，实时荧光定量检测试剂盒(Biosystems公司)。Sig-1R抗体、GRP75抗体、IP3R抗体、VDAC1抗体 和β-actin抗体(Abcam公司)。羊抗兔或羊抗鼠荧光二抗(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组及海马组织取材：小鼠按月龄分为：2(2 Mo)、6(6 Mo)、12(12 Mo)、18(18 Mo)和24月龄(24 Mo)，每组6只。 断头取小鼠双侧海马迅速冻存于液氮，在-80 ℃低温冰箱保存用于mRNA和蛋白表达检测。

1.2.2 海马组织总RNA提取和 real-time PCR 检测mRNA：用试剂盒提取海马组织中总RNA，将RNA用反转录试剂盒反转录成cDNA。然后利用针对VDAC1、GRP75、IP3R和Sig-1R的特异性引物按照实时荧光定量检测试剂盒说明方法检测其基因的变化，β-actin作为内参对照，引物序列如表1。

表1 RT-PCR 的引物序列Table 1 Primer sequence of RT-PCR

1.2.3 Western blot 检测海马组织VDAC1、IP3R、 GRP75和Sig-1R 蛋白表达：用裂解液进行海马组织匀浆, 提取全细胞蛋白、BCA法定量。蛋白样品进行电泳(12% SDS-PAGE), 转印到PVDF膜上，用1%脱脂奶粉封闭，然后与VADC1(1∶1 000)、IP3R(1∶1 000)、GRP75(1∶1 000)、Sig-1R(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗体孵育过夜，经TBST洗涤后再与羊抗兔(goat anti-rabbit IR Dye 680LT) 或羊抗鼠(goat anti-mouse IR Dye 800CW)荧光二抗孵育45 min，最后经过TBST洗涤后，用Odyssey双红外荧光成像系统进行成像和定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同年龄小鼠海马VDAC1、GRP75、IP3R 和Sig-1R mRNA的表达

在不同月龄组VDAC1 mRNA变化不明显。IP3R mRNA随年龄增长有降低趋势，24 Mo组与2 Mo组相比显著性降低(P<0.05)。随年龄增长GRP75基因表达明显增加，2 Mo、6 Mo组与12 Mo、18 Mo和24 Mo两两组间比较均有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。Sig-1R mRNA随年龄增长表达减少，24 Mo组与2 Mo、6 Mo组比较有显著性降低(P<0.01,P<0.05)(图1)。

2.2 不同年龄小鼠海马VDAC1、GRP75、IP3R、Sig-1R 蛋白表达

随年龄增长小鼠海马组织中VDAC1和IP3R的表达量在各月龄小鼠间变化不明显。老年小鼠(18 Mo、24 Mo组)比 年轻小鼠(2 Mo、6 Mo组)GRP75表达量明显增多， 18 Mo、24 Mo组与2 Mo、6 Mo组两两组间比较均有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。Sig-1R随年龄增长蛋白表达量减少，24 Mo组与2 Mo组比较显著性降低(P<0.05)(图2)。

3 讨论

线粒体和内质网之间的钙稳态失衡在衰老、神经退行性疾病中起着重要作用，通过调控MAM线粒体-内质网钙转运过程可以影响神经元的状态[7]。在长期培养的神经细胞内质网储钙调节能力降低，从内质网到线粒体的钙转运增加，线粒体摄钙增多破坏棘突稳定性，导致年龄相关的认知功能降低[8]。内质网与线粒体间Ca2+的交联是通过MAM募集 IP3R、GRP75、VDAC1、Sig-1R-BIP等数十种蛋白形成高钙微区，内质网释放的钙离子在较短的扩散范围内保持较高浓度，从而被线粒体摄取。用外源分子使MAM紧密连接膜间距更近，线粒体内钙离子浓度明显升高，线粒体钙超载，诱导细胞凋亡，而用蛋白酶水解使MAM物理连接解离，MAM膜间距增大，线粒体则不能摄取钙离子[9]。

衰老、神经退行性疾病等病理生理过程中MAM某些重要蛋白缺失或膜间距的变化对于钙信号传导和线粒体功能具有重要影响[10]。IP3R-GRP75-VDAC1复合物是实现内质网Ca2+释放和线粒体Ca2+摄取的重要结构，其中分子伴侣GRP75起着重要的连接作用。有研究认为在神经细胞中GRP75的主要作用是调节线粒体功能、Ca2+和氧化还原稳态，但在不同细胞不同状态下作用不同。在SH-SY5Y细胞中过表达GRP75降低生理状态ROS水平，GRP75在这些细胞中敲除则激活了线粒体应激反应[11]。在谷氨酸导致的氧化应激模型中敲除或沉默GRP75基因，减低内质网-线粒体连接，可缓解氧化应激导致的胞质和线粒体钙超载，阻断ROS生成，保护线粒体呼吸链，过表达GRP75则加强氧化应激导致的细胞死亡[12]。Sig-1R在各类神经细胞中分布广泛，有神经细胞再生、神经保护等多方面功能。 在生理和病理状态下都具有分子伴侣和感受Ca2+浓度的作用，在MAM Sig-1R通过和IP3R连接调节细胞钙信号和线粒体钙稳态[13]。

*P<0.05, **P<0.01 compared with 2 Mo group; #P<0.05 compared with 6 Mo group图2 不同月龄小鼠海马中VDAC1、GRP75、IP3R、Sig-1R蛋白表达

海马的全基因组表达谱被广泛用于研究人类死后脑组织中阿尔茨海默病(AD)的衰老和发病机制[14]。本实验对老年小鼠海马MAM钙信号传导相关蛋白进行了基因水平和蛋白水平的检测，发现小鼠海马组织中GRP75 mRNA和蛋白表达在增龄过程中明显升高， Sig-1R在增龄过程中 mRNA和蛋白表达降低。提示MAM钙信号传导是调节应激状态细胞内钙超载和随后的细胞衰老死亡的一个重要途径，GRP75、Sig-1R可作为靶向神经细胞衰老时MAM钙信号传导过程的关键分子，为进一步开展衰老及抗衰老生理及抗衰老药物研究提供了实验依据。