SP-C基因exonⅡ结构基因突变与新生儿呼吸窘迫综合征的关系

牛银萍 ，郭淼 ，付朝阳 ，王喆

(1、南阳市第二人民医院儿科，河南 南阳473000；2、南阳市第二人民医院检验科，河南 南阳 473000)

新生儿呼吸窘迫综合征 （neonatal respiratory distress syndrome，NRDS）是临床上较为常见的呼吸系统疾病，流行病学研究显示，NRDS的发病率可达233～455/1万人左右，在孕周介于28～32周之间时，NRDS的发病率可进一步上升[1]。

表面活性物质蛋白C（surfactant protein C，SPC）的功能状态或者表达缺失是影响到NRDS发生的重要因素，蛋白水平的修饰或者空间结构的改变，能够通过影响到SP-C的合成量及生理功能，促进NRDS的发生[2]。SP-C基因exonⅡ结构基因突变能够通过影响到SP-C的表观遗传学的改变，影响到肺泡表面凝脂的分泌，降低了SP-C前体成分的卷曲、末端修饰及磷酸化等过程，增加了肺泡扩张过程中肺泡表面张力，促进了肺泡的萎缩[3，4]。部分研究揭示了SP-C蛋白的表达异常对于NRDS的发生的影响，认为SP-C的表达下降是促进NRDS发生的重要因素[5]，但对于基因水平的改变研究不足。为了进一步探讨SP-C基因exonⅡ结构基因突变与新生儿呼吸窘迫综合征的关系，本研究选取2014年2月至2017年12月在我院治疗的NRDS患儿110例，探讨了exonⅡ基因突变与NRDS临床特征的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年2月至2017年12月在我院治疗的NRDS患儿110例（NRDS组），纳入标准：⑴符合《实用新生儿学》第4版中的诊断标准；⑵患儿监护人知情同意。排除标准：⑴有严重先天性疾病、遗传代谢性疾病、严重窒息等；⑵母亲孕后期有明确感染史；⑶孕期糖尿病、胎膜早破。同时选取新生儿病房住院未发生NRDS患儿110例作为对照组，两组患儿性别、胎龄、出生体重及母亲年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。本研究获得医院伦理委员会批准。

表1 两组患儿一般资料比较

1.2 试剂和方法 离心机minix-6k购自上海精密仪器有限公司，Applied Biosystems ABI 2720购自美国墨塞飞公司，荧光PCR试剂盒Real-Time PCR Reagents&Kits购自美国墨塞飞公司。

1.3 检测方法 采集患者抗凝血5ml（2.5%枸椽酸钠溶液抗凝），按照10000r/min的离心速度进行离心分离血清，每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温 3min，12000×g，4℃离心 15min 得到 RNA。加等体积异丙醇，-20℃，30min，弃上清，加75%乙醇 1ml，振荡，20μl DEPC 水，室温放置 5min 使其完全溶解。加入逆转录酶5ul，室温下放置20min后植入37℃水浴锅中孵育30min，在底物中加入上游引物0.5uM、下游引物0.5uM，RT-PCR反应混合液 5ul，dNTP 稀释至 20ul， 反应条件：95℃3min、95℃15s、90℃5s，一共 40 个循环，产物扩增长度为134bp。

1.4 统计学处理 统计分析采用SPSS 19.0软件，计量资料采用（±s）表示，组间比较使用t检验，计数资料比较使用χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SP-C基因exonⅡ基因突变筛查 SP-C基因exonⅡ基因测序发现，第115位基因位点发现杂合突变c.115G＞T，为错义突变，基因型为G/T（突变型），c.115G＞T突变基因测序序列见图1。

图1 SP-C基因exonⅡ的测序图

2.2 两组SP-C基因exonⅡ c.115G＞T基因突变分析 NRDS组G/T基因型比例为8.18%，明显高于对照组，差异比较有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组SP-C基因exonⅡc.115G＞T基因突变基因型比较

2.3 SP-C基因 exonⅡ c.115G＞T基因突变与NRDS临床特征关系 G/T患儿胸片Ⅲ～Ⅳ级比例和病死率分别为100.00%和66.67%，明显高于GG型患儿（P＜0.05）；G/T 和 GG 型患儿性别、胎龄、出生体重、使用机械通气比例和PS使用3～4剂比例差异比较无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 SP-C基因exonⅡc.115G＞T基因突变与NRDS临床特征关系

3 讨论

在孕周小于28周的早产儿中，NRDS的发病率可达65%以上，而在孕周介于28~37周的早产儿中，NRDS的发病率可达 1.5%~15%左右[6]。NRDS的病情进展，可以导致患者远期生存预后的恶化，流行病学研究显示，NRDS的临床总体治疗效果仍然较为局限，糖皮质激素等治疗后的病情缓解率不足35%，孕周小于34周的早产儿NRDS治疗后病死率仍然可达27%以上[7]。NRDS的发生呈现出了一定的区域性差异，提示基因水平的改变可能是影响到NRDS发生的重要因素[8]。基因的改变能够通过影响肺泡表面活性物质的合成，导致磷脂成分比例的下降，降低了磷脂单分子层的稳定性[9，10]。通过揭示NRDS患者表观遗传学或者基因水平改变的结局，能够为后续临床上NRDS的治疗、预后评估或者随访等提供参考指标。

SP-C基因exonⅡ是SP-C上游转录末端的最后一个外显子，其转录活性的改变能够提高SP-C的合成速度，并稳定磷脂及蛋白的比例，提高其对于磷脂细菌表面多糖成分的抵御能力。部分研究认为，SP-C基因exonⅡ能够提高SP-C蛋白在肺泡表面的扩散能力，降低局部氧化应激障碍等导致的肺泡张力的增加[11]。另外，在敲除了SP-C基因exonⅡ基因的小鼠中，可以发现显著的早产子代NRDS的发生或者成熟子代肺不张及肺功能衰竭的发生[12]。在人群对照试验中可以发现的是，SPC基因exonⅡ基因的异常表达在部分研究中有少量报道，认为SP-C基因exonⅡ的基因点突变或者错义突变是促进患者SP-C发生的重要因素，但缺乏SP-C基因exonⅡ点突变与患儿临床结局的关系研究。

可以发现的是，第115位基因位点发现杂合突变c.115G＞T，为点突变，G/T位点的点突变能够影响到下游SP-C基因的翻译及转录活性，影响到SP-C蛋白的生物学功能，同时在病例组中G/T类型的表型的比例更高，提示G/T位置的点突变或者表型的改变均可能显著参与到了NRDS的发病过程中，从机制上考虑G/T位点的点突变或者基因型的改变对于NRDS发生的影响，考虑可能与下列几个方面的因素有关[13]：⑴exonⅡc.115G＞T基因突变导致内质网氨基酸转运过程的异常，影响到了SP-C蛋白的合成速度；⑵exonⅡc.115G＞T基因突变的发生，能够通过影响到G/T表型的变化，促进患者体内肺泡表面活性物质的末端磷酸化修饰过程的障碍，导致SP蛋白特别是SP-C蛋白生物学活性的下降。有研究者[14，15]在探讨了NRDS患者的体内基因表观遗传学的改变后发现，exonⅡ c.115G＞T基因突变可以增加5%左右的NRDS的发生率，同时相应位置点突变的发生能够导致患者Ⅱ型上皮细胞功能的代偿障碍，降低肺泡表面薄膜的稳定性。G/T患儿胸片Ⅲ～Ⅳ级比例和病死率明显高于GG型，差异具有统计学意义，提示不同的exonⅡc.115位置表型的改变能够显著影响到NRDS患儿的临床预后，增加恶性临床结局的发生风险，这主要考虑与GT基因型的改变能够促进下游体内SP-C蛋白的错误折叠及四级空间结构的形成，并能够通过影响到内质网囊泡运输体的ATP能量利用障碍，导致患者SP-C蛋白的合成后运输过程异常，肺泡表面活性物质含量及生物学活性明显下降，肺部实质性病变明显增强，而病死率也明显增加。但并未发现胎龄、出生体重、使用机械通气比例等与exonⅡc.115的关系，提示exonⅡc.115可能主要影响到NRDS的远期生存预后。

综上所述，SP-C基因exonⅡ c.115G＞T基因突变可能与NRDS的发生具有一定的关系，并与患者的病死率等临床特征相关。