酱油中生物胺的形成机制及其测定

王青华，范桂强，张咚咚

(1.天津科技大学 食品工程与生物技术学院 食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457；2.衡水市食品药品检验检测中心，河北 衡水 053000)

生物胺是一类含氨基的低分子质量且具有一定生物活性的有机化合物的总称，广泛存在于多种食品中，尤其是鱼类及其相关产品，酒类、肉类、干酪、豆制品及其他发酵制品中。组胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺、苯乙胺和色胺被认为是食物中最普遍的生物胺[1]。

食品中的生物胺由于其潜在的生理和毒性作用对人类健康产生了极大危害。如果摄入过量的生物胺会引起一系列的健康问题，会出现如头痛、恶心、血压不稳、心悸等症状，在各类生物胺中，普遍认为对人类健康危害最大的是组胺和酪胺[2,3]。

1 酱油中生物胺的形成

1.1 生物胺的生理作用

组胺在哺乳动物的脑部组织中，在充当过敏症[4]、胃酸分泌[5,6]、神经传递介质化学调节剂方面起到很大的作用[7,8]。当食品中组胺含量较低时，该食品不会被认为存在健康风险；在体内，长期缺乏组胺和组胺过量都会引起神经和生理方面的功能失调。但当摄入量超过1000 mg/kg时，会直接导致食物中毒如干酪综合症等[9,10]，严重的会引起明显的生理和毒性危害。组胺含量异常会出现明显的功能失调症状如胃疾病、肥大细胞症、骨髓性白血病等[11]。

酪胺，又名p-对羟基苯乙胺，据报道，摄入大量含酪胺的食品后会引起明显的毒性作用[12]。还有文献说明患有偏头痛的病人摄入含有酪胺的食品后会加重偏头痛的病情[13,14]。酪胺还会加速神经末梢血管收缩，剌激心律加快，增加血糖浓度。人体摄入酪胺超过100 mg会引起偏头痛症状，超过1080 mg会引起严重的中毒性肿胀。

1.2 酱油中生物胺的形成机制

从世界范围看，中国是酱油起源最早的国家，酱油是中国传统的发酵型调味品，主要是由豆粕、面粉、麸皮和小麦等为原料，在多种微生物主要是曲霉属真菌作用下发酵而成的。在酱油制作发酵过程中，在由米曲霉和大豆疫酶产生的蛋白酶的作用下，原料中的蛋白质被水解成小分子的肽类、氨基酸和氨类[15]。酱油特有的风味在发酵和老化过程中逐渐形成，同时形成了高含量的自由氨基酸，自由氨基酸的产生使酱油产生特有的风味，同时可能也是生物胺潜在的主要来源。

生物胺是酱油在长期发酵过程中非常容易产生的一类有害物质。生物胺主要是由微生物脱羧酶在辅酶5-磷酸吡哆醛的作用下，作用于相应的氨基酸，脱去羧基所形成的胺。生物胺的形成需要具备以下条件：存在可以分泌氨基酸脱羧酶的微生物；有相应氨基酸的存在；有利于相关微生物生长，可以提高相应脱羧酶活性的环境。

2 生物胺的检测方法

目前，检测生物胺的方法主要是高效液相色谱法、气-质联用法[16]、酶学测定法[17]等。其中最常用的是高效液相色谱法。由于高效液相色谱法较为成熟，可以同时测定一类物质的多种类物质的含量，本方法采用高效液相色谱方法同时测定最重要的2种生物胺——组胺和酪胺的含量。本研究测定了3种常见市售酱油中的组胺和酪胺含量，为消费者的饮食提供了一定的膳食指导。

2.1 实验材料与方法

2.1.1 仪器设备

Agilent 1260液相色谱仪(配紫外检测器) Agilent公司；涡旋混合器 美国Talboys公司；高速离心机 日立公司；分析天平。

2.1.2 试剂及材料

乙腈、丙酮、甲醇：均为色谱纯；乙酸铵、氨水(25%)、NaHCO3、氢氧化钠、高氯酸：均为分析纯；丹磺酰氯、组胺和酪胺标准品：Sigma-Adrich公司，纯度均大于99%；实验用水：均为双蒸水，并经 Milli-Q超纯水处理。厨邦味极鲜酱油、厨邦蒸鱼豉油、李锦记蒸鱼豉油、欣和六月鲜：均购自衡水吉美超市。

2.2 实验过程

2.2.1 样品预处理

分别取2 mL酱油于10 mL离心管中，用0.4 mol/L高氯酸稀释至刻度，置于涡旋混合器上混合5 min，待用[18]。

2.2.1.1 样品衍生化

分别吸取0.1 mL样液注入到螺帽瓶中，加入2 mol/L NaOH 0.2 mL溶液调节溶液pH值，饱和 NaHCO3溶液0.3 mL和丹磺酰氯丙酮溶液(10 mg/mL)1.0 mL，将上述混合物在40 ℃条件下于暗处搅拌30 min，然后加少量氨水使多余的丹磺酰氯沉淀，过滤，将上清液转移到容量瓶中，用乙腈定容至5 mL，过0.45 μm滤膜后进行色谱分析。

2.2.1.2 标准储备液的制备

称取一定量的组胺和酪胺标准品，用 0.4 mol/L 高氯酸配制成浓度为 1 mg/mL 的组胺和酪胺标准溶液，放于冰箱中4 ℃保存，每周一配。精确称取适量丹磺酰氯，用丙酮溶解并配制成浓度为 10 mg/mL的溶液，经过 0.45 μm 针头微孔滤膜过滤器过滤后，于4 ℃冰箱中保存备用。

2.2.1.3 组胺和酪胺标准溶液的衍生化过程

配制浓度为5,20,50,100,200，500 μg/mL的组胺标准溶液和浓度为2,8,20,40,80，200 μg/mL的酪胺混合标准溶液，取0.1 mL含有不同浓度的组胺和酪胺的混标溶液，具体衍生过程同2.2.1.1。

2.2.2 色谱条件

色谱条件：Agilent 1100色谱仪，流动相为V(乙腈)∶V(乙酸铵)为80∶20，进行等度洗脱；流速：1 mL/min；色谱柱：Waters Nova-Pak C18(250 mm×4.6 mm) Column；配有紫外检测器；检测波长为254 nm，进样量为20 μL，柱温 为40 ℃。

2.3 结果与讨论

2.3.1 色谱条件

实验过程中选用了甲醇、乙腈、乙酸及乙酸胺等溶液搭配使用来选择流动相，结果发现乙腈和乙酸铵搭配使用最为合适，本实验之所以使用等度洗脱和梯度洗脱，是由于实验中为了优化测定色谱条件，减少整个测定过程的时间，消除其他干扰物质的影响。

考察了柱温对组胺和酪胺出峰的影响后发现柱温变化时组分出峰顺序没有变化，但分析时间随柱温升高而缩短。

2.3.2 样品提取

本实验采用水、盐酸、甲醇、正丁醇、丙酮、三氯乙酸、高氯酸等溶剂作为提取溶剂进行实验，结果发现 0.4 mol/L高氯酸溶液提取效果较好，因此选用0.4 mol/L高氯酸溶液作为提取剂。

2.3.3 衍生化过程

本文选用了邻苯二甲醛、 磺酰氯二甲胺偶氮苯、丹磺酰氯、异硫氰酸苯酯、荧光胺、氯甲酸(9-芴醇)甲酯作为衍生试剂，结果发现使用丹磺酰氯进行衍生效果很好，衍生方法也比较简单。

由于生物胺在弱碱性条件下才能与丹磺酰氯发生反应， 因此样品在衍生前先用氢氧化钠溶液调节pH至中性，再用碳酸氢钠溶液调节 pH至8.5～9.0。丹磺酰氯衍生在40 ℃条件下反应30 min。当衍生45，90，150 min实验时，结果显示在不同的衍生时间峰面积没有明显差异，因此，没必要进行太长时间的衍生过程。

2.3.4 衍生物的稳定性

通过对 2 mg/L的标准品衍生物做稳定性试验，发现放置在4 ℃、避光条件下，衍生物在2周内的峰面积变化不大，但第3周开始峰面积明显降低。因此，衍生物在4 ℃、避光条件下，可保存2周。

2.3.5 标准工作曲线

将上述配制成一系列浓度梯度的组胺和酪胺的混合标准溶液分别进行进样分析，在以上2种实验条件下，分别进行色谱分析，分别以组胺和酪胺的色谱峰面积(Y)为纵坐标，以相应的浓度为纵坐标绘制标准曲线，结果表明在上述2种色谱条件下，组胺在5～500 μg/mL，酪胺在2～200 μg/mL的浓度范围内均有良好的线性关系，线性回归方程分别为：

组胺：Y=16.6560+25.1341X，相关系数为r=0.99999；酪胺：Y=296.7579+29.3575X，相关系数为r=0.99990。

其中，Y为生物胺的峰面积，X为衍生前对应的生物胺的浓度。由此可见，峰面积和生物胺浓度呈良好的线性相关性，测定结果良好可靠。

图1 组胺和酪胺混标溶液液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram of mixed histamine and tyramine solution

2.4 测得的结果

测定4种市售酱油中组胺和酪胺的含量，结果见表1。

表1 2种色谱条件下测得的酱油中组胺的含量Table 1 Determination of histamine in soy sauce under two chromatographic conditions

由表1可知，在市售常见的这4种酱油中，厨邦蒸鱼豉油中酪胺的含量最高，酪胺的含量为713.54 μg/mL，欣和六月鲜酱油中组胺的含量最高，组胺的含量为522.28 μg/mL。因此，在食用酱油时，根据酱油的品牌和种类控制食用量，否则对人体健康会造成很大的危害。

2.5 加标回收实验

为了进一步评价2种色谱条件下测定的准确度和精密度，本研究以厨邦味极鲜酱油为研究对象，在此样品中分别添加组胺标准溶液和酪胺标准溶液，制成浓度分别为1000,400,200 μg/mL组胺和浓度分别为800，320，160 μg/mL的酪胺加标样品进行加标回收实验，结果见表2和表3。

表2 组胺的加标回收实验Table 2 Recovery of histamine under different chromatographic conditions

表3 酪胺的加标回收实验Table 3 Recovery of tyramine under different chromatographic conditions

由表2和表3可知，组胺的加标回收率在101.61%～112.82%之间，酪胺的加标回收率在104.12%～112.92%之间。

3 结论

该研究针对组胺和酪胺测定的液相色谱条件进行了优化，测定了常见的酱油中对人体危害最大的组胺和酪胺的含量，从而可以对不同人群的膳食指导做出一定的贡献。关于食品中组胺的允许水平，我国规定了水产品中组胺的限量标准[19]，鲐鲹鱼类不得高于1000 mg/kg，其他红肉鱼类不得高于300 mg/kg。然而上述大豆发酵制品、酸奶和啤酒食品中组胺的含量也可能会比较高，我国却尚未做出相关的限量规定，应进一步完善和健全食品安全标准体系。