糖肾方对db/db小鼠肾脏纤维化的保护作用

刘鹏 陈姣伊 刘言振�┱枣面� 张浩军 严美花 赵海玲 李平

摘要 目的：观察糖肾方（TangShenFang，TSF）对于自发性2型糖尿病肾病db/db小鼠肾脏纤维化的保护作用。方法：8周龄雄性db/db小鼠随机分为2组，分别为模型组（db/db）和观察组（db/db+TSF），每组9只；8周龄雄性db/m小鼠为正常对照组（db/m），顺应性喂养2周后，给予糖肾方干预12周，处死小鼠，分离小鼠肾脏用于后续检测。利用PAS和Masson染色观察肾脏病理；利用WesternBlotting、Real-timePCR和免疫组化等技术检测肾脏组织纤维化TGF-β1/Smad3通路以及miRNA21和miRNA29b的表达。结果：糖肾方可以改善db/db小鼠尿微量白蛋白水平，减轻小鼠肾脏损伤；WesternBlotting、Real-timePCR和免疫组化结果显示，糖肾方可下调db/db小鼠肾脏中纤维化标志分子TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ和Fibronectin的表达；下调db/db小鼠肾脏miRNA21的表达，上调miRNA29b的表达。结论：糖肾方可作用于TGF-β1/Smad3信号通路抑制肾脏纤维化。

关键词 糖肾方；糖尿病肾病；肾脏纤维化；miRNA

AbstractObjective：ToobservetheeffectsofTangshenFormula（TSF）treatmentonrenalfibrosisandexploreitspotentialmechanismindb/dbmice.Methods：Eightweeksolddb/dbanddb/mmicewererandomlydividedintothreesubgroups，（db/m，db/db，db/db+TSF），andallmicewerefedwithanormaldiet.Aftertwoweeksadaptation，miceweremaintainedonTSFtreatmentfor12weeksandwerethensacrificedunderanesthesiaafterovernightfast.Animalurineandrenaltissuessampleswerecollectedforfurtheranalyses.ThekidneyswerewashedwithcoldPBSsolution；onepartoftherenaltissuewerestoredinliquidnitrogen，andanotherdeposited-80℃directlyforsubsequentfrozensections；therestofthekidneywerefixedintotheneutralformalinforpathologicalanalysis.TherenalfibrosiswasdetectedbyPASandMassonstaining.TherenalexpressionofTGF-β1/Smad3anditstargetgeneswereassessedbyWesternBlotting，real-timePCR，andIHC.Results：TSFdiminishedUACRofdb/dbmice.HistologicalanalysisusingPASandMassonstainingrevealedtheoccurrenceofmesangialmatrixexpansionandextracellularmatrixdepositioninthekidneysofdb/dbmice.ThetreatmentwithTSFsignificantlyamelioratedthesehistologicalrenalinjuriesindb/dbmice.WesternBlottingandreal-timePCRanalysisshowedthatexpressionlevelsofTGF-β1，Smad3，CollagenⅠandFibronectinweresignificantlydownregulatedinthedb/dbmicewithTSFtreatment.WithTSFtreatment，theexpressionlevelsofmiRNA21wasdownregulated，buttheexpressionlevelsofmiRNA29bwasupregulated.Conclusion：TSFattenuatedrenalfibrosisindb/dbmice，throughsuppressionofTGF-β1/Smad3pathway.

KeyWordsTangshenformula；Diabeticnephropathy；Renalfibrosis；miRNA

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.010

糖尿病肾病（DiabeticNephropathy，DN）是糖尿病（DiabetesMellitus，DM）主要的微血管并发症之一，已成为发达国家和我国发达地区终末期肾病（EndStageRvenalDisease，ESRD）的主要原因[1-2]。DN主要病理改变是由于细胞外基质的过度沉积，肾小球基底膜的厚度增加，进而导致系膜增殖和扩张，最终发展成为肾小球硬化和腎脏纤维化，丧失正常的功能。在DN的早期阶段（微量白蛋白尿阶段），胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白在肾小球基底膜和系膜细胞外基质中的沉积明显增加，导致糖尿病弥漫性肾小球硬化症；在晚期阶段，肾脏中Ⅰ型和Ⅲ型胶原明显沉积[3]。由此可见，纤维化是DN肾脏病理的最主要特征。转化生长因子-β1（TGF-β1）是一种广谱细胞因子，可被高血糖、晚期糖基化终产物（AdvancedGlycationEnd-products，AGEs）、促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedProteinKinase，MAPK）和蛋白激酶C（ProteinKinaseC，PKC）等多种途径诱导，在导致DN纤维化过程中发挥着决定性的作用[4]。多项研究表明TGF-β1/Smad3信号通路是引起糖尿病肾病肾脏纤维化的重要通路，此外TGF-β1还可通过调控一些微小RNA（MicroRNA，miRNA）进一步引起肾脏损伤（如：miRNA21，miRNA29等）[5-6]。因此，TGF-β/Smad3信号通路已成为防治DN的重要靶点之一。

目前的治疗方案尚不能产生显著的疗效，因此迫切需要新的治疗方法来减缓DN的进展[7]。中医药是祖国瑰宝，同时国内的糖尿病肾脏疾病（DiabeticKidneyDiseases，DKD）患者广泛接受中医药的治疗[8]。中药糖肾方（TangshenFormula，TSF）颗粒是由七味药组成，分别为黄芪、生地黄、山茱萸、三七、卫矛、熟大黄和枳壳，是李平教授团队在继承名老中医经验基础上，结合自身临床实践和现代研究成果拟定的中药复方。在国家“973计划”和国际科技合作等项目资助下，课题组前期多中心临床试验证实糖肾方可以减少DKD患者尿蛋白排泄率，改善肾小球滤过率[9]。本研究主要探讨糖肾方对于肾脏纤维化的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物雄性自发性2型糖尿病db/db小鼠，8周龄，体重（35±5）g；同遗传背景db/m小鼠，体重（20±2）g，购自北京大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（京）2011-0001。小鼠均饲养于中日友好医院SPF级实验动物室屏障环境，使用许可证号：SYXK（京）2010-0011。温度：（23±3）℃，相对湿度（55±15）%，保持12h光照/12h黑暗交替，自由饮水和常规饲料喂养。本次实验所有操作均严格按照实验动物伦理相关规定进行。

1.1.2药物糖肾方配方颗粒，由江阴天江药业有限公司制剂，规格：8g/袋，批号：1206346。糖肾方组成药物为：黄芪、卫矛、生地黃、枳壳、山茱萸、大黄、三七7味中药，其重量比依次为10∶5∶4∶3.4∶3∶2∶1。

1.1.3试剂与仪器小鼠白蛋白Elisa试剂盒（美国BethylLaboratories公司）；iQTMSYBRGreensupermix（美国Bio-RAD公司）；蛋白预染Marker（中国天根生化科技有限公司）；PVDF膜（德国MerckMillipore公司）；CollagenⅠ抗体（美国SantaCruz公司）；Fibronectin抗体（美国SantaCruz公司）；Smad3抗体（美国CellSignalingTechnology公司）；P-Smad3抗体（美国CellSignalingTechnology公司）；β-actin抗体（美国SantaCruz公司）；辣根酶标记兔抗小鼠IgG（美国DAKO公司）；Trizol试剂（美国SantaCruz公司）；QuickstartBradfordDyeReagent（美国Bio-RAD公司）；TaqmanmiRNA试剂盒（美国ThermoFisher公司）；BSA（美国Amresco公司）。CD-1600全自动生化分析仪（美国雅培公司）；BX43型光学显微镜（日本Olympus公司）；多功能酶标仪（美国ThermoFisher公司）；PH仪（美国ThermoFisher公司）；垂直凝胶电泳系统（美国Bio-RAD公司）；Nanodrop高精度核算分光光度计（美国ThermoFisher公司）；PCR仪（美国Bio-RAD公司）；real-timePCR仪（美国Bio-RAD公司）。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备实验动物购入后，顺应性喂养2周，称重并进行基础状态观察，于10周龄时根据体重将db/db小鼠随机分为2组。

1.2.2给药方法动物分组后从第1天开始灌胃给药，1次/d，每周称重，连续给药12周。糖肾方剂量参考前期临床研究并按照标准动物剂量换算[10]，根据体重按照体表面积进行换算，糖肾方的临床给药剂量是16g/d，按照人的标准体重为60kg计算，小鼠体重按照20g计算，小鼠给药剂量应为人给药剂量的9倍，则小鼠给药剂量为还是2.4g/（kg·d）[9]。糖肾方颗粒剂按照0.18g/mL的浓度进行配制，4℃保存，灌胃前取出恢复至室温，混匀后备用。各组小鼠灌胃给药方案如下表所示见，表1.1。

1.2.3标本采集实验期间从给药0周开始，每4周将小鼠转移入代谢笼一次，小鼠禁食但不禁水，收集24h尿液后测定尿量，混匀后留取1.5mL，10000rpm4℃离心5min，留取上清液，保存于-80℃冰箱用于检测尿白蛋白及尿肌酐水平。在给药12周实验结束时，小鼠禁食12h后，眼內眦取血，3000r/min4℃离心15min，留取上清液，保存于-80℃冰箱用于检测各项生化指标。之后迅速打开小鼠腹腔，摘取双侧肾脏，分别称重。一侧肾脏去除髓质后，一半置于10%中性福尔马林溶液中固定，另一半置于4%多聚甲醛中固定；另一侧分离出肾皮质，迅速置于干燥冻存管中，于液氮保存。

1.2.4检测指标与方法取尿液上清，检测尿白蛋白浓度和尿肌酐；并计算尿白蛋白肌酐比值（UrineAlbumin-to-CreatinineRatio，UACR）。肾组织经过10%中性福尔马林固定24h后，依次进行脱水、透明、石蜡包埋后，使用切片机分别切为3μm厚切片，进行过碘酸-雪夫（PeriodicAcid-Schiff，PAS）染色和Masson染色，光镜下观察肾脏组织病理变化，采用评分法对其进行半定量分析。采用WesternBlotting以及免疫组化法检测肾脏组织中Smad3、P-Smad3、CollagenⅠ和Fibronectin的表达情况，采用Real-timePCR检测肾脏组织中TGF-β1Smad3、CollagenⅠ和Fibronectin的mRNA水平以及miRNA21和miRNA29b的表达情况。

1.3统计学方法所有计量数据均以均数±标准误（±s）表示，采用GraphPadPrism5.0软件进行统计分析，采用One-wayANOVA分析和Dunnett-t多组间比较等检验方法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1糖肾方对db/db小鼠UACR的影响尿微量白蛋白是评价DN病情进展的重要指标，本研究中以尿肌酐进行校正，使用UACR作为评价病情进展。如图1.1B所示。在10周龄实验开始时，模型组db/db小鼠UACR显著高于正常组db/m小鼠，而模型组与糖肾方组db/db小鼠UACR无明显差异；从18周龄开始，在给予糖肾方干预后，db/db小鼠UACR显著降低，抑制病情进展。图1.1中，db/m表示正常对照组，db/db表示模型组，db/db+TSF表示糖肾方观察组。

2.2糖肾方显著改善db/db小鼠肾脏病理损伤肾脏组织经过PAS染色后，糖原在光镜下呈紫红色颗粒。如图1.2A所示。正常组db/m小鼠肾小球的结构正常，系膜区阳性物质未见增多；模型组db/db小鼠肾小球官腔的结构异常，系膜区阳性物质明显增多，同时伴有系膜基质显著增生以及基底膜增厚；在给予糖肾方干预后，可明显改善db/db小鼠肾小球系膜基质的増生及基底膜增厚，同时对肾小球系膜基质百分比进行半定量分析，结果具有统计学差异。见图1.2B。

经过Masson染色后，胶原在光镜下呈现蓝色。如图1.2C所示。正常组db/m小鼠肾小球和肾小管的结构正常，胶原表达未见增多；模型组db/db小鼠肾小球系膜区及基底膜胶原出现明显的增生，同时出现肾小管扩张；给予糖肾方干预后，可明显减少db/db小鼠肾小球及小管间质的胶原沉积，使用纤维化面积进行半定量分析，结果具有统计学差异。见图1.2D。

2.3糖肾方对db/db小鼠肾脏皮质CollagenⅠ和Fibronectin蛋白及mRNA水平的影响如图1.3所示，免疫组化检测发现，模型组db/db小鼠肾脏皮质CollagenⅠ和Fibronectin白水平显著高于正常组db/m小鼠，在给予糖肾方干预后，db/db小鼠肾脏皮质Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白水平显著下降，结果具有统计学差异。见图1.4所示。WesternBlotting检测发现，模型组db/db小鼠肾脏皮质CollagenⅠ和Fibronectin蛋白水平显著高于正常组db/m小鼠，在给予糖肾方干预后，db/db小鼠肾脏皮质Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白水平显著下降。如图1.5所示。Real-timePCR检测发现，模型组db/db小鼠肾脏皮质Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白mRNA水平显著高于正常组db/m小鼠，在给予糖肾方干预后，db/db小鼠肾脏皮质Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白mRNA水平显著下降。

2.4糖肾方对db/db小鼠肾脏皮质TGF-β1/Smad3信号通路的影响如图1.6所示，WesternBlotting检测发现，模型组db/db小鼠肾脏皮质中Smad3蛋白磷酸化水平显著高于正常组db/m小鼠，在给予糖肾方干预后，db/db小鼠肾脏皮质Smad3蛋白磷酸化水平显著下降。如图1.7所示，real-timePCR检测发现，模型组db/db小鼠肾脏皮质中TGF-β1mRNA水平显著高于正常组db/m小鼠，在给予糖肾方干预后，db/db小鼠肾脏皮质TGF-β1mRNA水平显著下降。

2.5糖肾方对db/db小鼠肾脏皮质miRNA21和miRNA29b的影响miRNA是可以调节各项生命活动的小内源非编码RNA，抑制目标基因翻译和/或诱导mRNA降解，Smad3介导的miRNA（例如：miRNA21，miRNA29等）在糖尿病肾脏纤维化过程中发挥着重要作用。如图1.8所示，real-timePCR检测发现，模型组db/db小鼠肾脏皮质中miRNA21水平显著高于正常组db/m小鼠，miRNA29b水平显著低于正常组db/m小鼠；在给予糖肾方干预后，db/db小鼠肾脏皮质中miRNA21水平显著下降，miRNA29b水平显著升高。

3讨论

我国已经成为了全球DM患者最多的国家，而且患病人数还在继续增加，最新的研究显示我国目前DM的患病率已经达到了10.9%，同时糖尿病前期的人口预计在35.7%[11]。DN作为DM主要的微血管并发症之一，已成为ESRD的主要病因，严重威胁着人类的健康，给国家和社会造成了巨大的经济负担[1]。本研究发现糖肾方可显著抑制TGF-β1/Smad3信号通路的表达，下调Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的表达，减轻肾脏纤维化；此外研究还发现糖肾方还可通过下调肾脏中miRNA21的表达以及上调miRNA29b的表达，抑制肾脏纤维化的进展，保护肾脏功能。

TGF-β1/Smad3信号通路是引起糖尿病肾病肾脏纤维化的重要通路，可引起ECM的过度沉积，导致肾脏纤维化[6]。DN状态下的许多物质，例如高血糖水平、AGEs及血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）都可上调TGF-β1的表达，并通过依赖及非依赖TGF-β1途径激活Smad信号通路。Smad3可直接结合到胶原蛋白的启动子区域，来上调胶原蛋白的表达，促進肾脏的纤维化进展[12-13]。同时降低成纤维细胞中的基质金属蛋白酶-1（Matrixmetalloproteinase-1，MMP-1）活性，减少胶原蛋白的降解[14]。DN、UUO、高血压肾损害及药物导致的肾损害动物模型中，敲除Smad3均可抑制肾脏的纤维化[15-18]。TGF-β1/Smad信号通路导致肾脏纤维化的主要机制有：1）可通过诱导胶原和纤维连接蛋白的表达，直接引起ECM的过度沉积[19]；2）可诱导上皮细胞通过上皮-间质转分化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）转化为肌成纤维细胞，诱导巨噬细胞通过巨噬细胞-肌成纤维细胞转化肌成纤维细胞（Macrophage-myofibroblasttransition，MMT），以及诱导内皮细胞-间质转分化（Endothelial-mesenchymaltransition，EndMT）为肌成纤维细胞[20-21]；3）可诱导肾小球系膜细胞分泌增强，导致系膜基质增多；还可诱导肾小管上皮细胞和足细胞的凋亡，影响肾脏正常的功能，加重肾脏的纤维化[22]；4）降低成纤维细胞中的MMP-1活性，减少胶原蛋白的降解[14]。所以，TGF-β1/Smad信号通路的激活可显著促进肾脏纤维化的进展，可作为治疗DN的潜在靶点。

在一项纳入1604例DN患者的meta分析中发现，DN患者的血清和尿液中的TGF-β1含量显著升高[23]。一些TGF-β1的抑制剂已经进行了临床前和临床研究，但由于不良反应以及疗效不显著等原因，还尚未得到广泛的应用[24]。在一项有77例DN患者参与的随机双盲安慰剂对照研究中发现，一种可以阻断TGF-β1启动子的小分子药物Pirfenidone，可延缓DN患者的肾小球滤过率（EstimatedGlomerularFiltrationRate，eGFR）的下降[25]。但在有36例激素抵抗型原发局灶性节段性肾小球硬化症的随机双盲安慰剂对照研究中发现，给予人源的TGF-β1单克隆抗体fresolimumab（GC1008）后并未发现患者的eGFR有明显改善[26]。

miRNA是可以调节各项生命活动的小内源非编码RNA，长度为20～22个核苷酸，可与靶基因的3′端非翻译区结合，抑制目标基因翻译和/或誘导mRNA降解，其中一些miRNA（例如：miRNA21，miRNA29等）在糖尿病肾脏纤维化过程中发挥着重要作用[6]。miRNA21是被广泛研究的miRNAs之一，早在2008年的一项研究中发现，心力衰竭模型中miRNA21可加重心脏的纤维化[27]。尽管在正常肾脏中miRNA21的含量比较低，但是在多种肾脏疾病模型中，例如糖尿病肾病和急性肾小球肾炎的动物模型中，均可发现miRNA21表达升高，肾脏发生纤维化改变[28-29]。已有大量研究表明，TGF-β1可上调miRNA21的表达；在敲除TGF-β1的糖尿病模型中，miRNA21的表达减少，肾脏纤维化程度减轻[30]。因此，miRNA21可成为改善纤维化相关疾病的重要靶点；在敲除miRNA21的小鼠模型中也进一步证实，敲除miRNA21后，可抑制肾脏的纤维化[31]。也有研究证实，miRNA21的表达是由Smad3调控的，Smad3的激活可以上调miRNA21的表达[29]。此外，miRNA21还可通过其他途径促进肾脏纤维化，包括：1）miRNA21可抑制肾脏过氧化物酶体增殖物激活受体α（Peroxisomeproliferator-activatedreceptorα，PPARα）的表达，干扰正常的脂质代谢，引起肾脏脂质沉积，继而导致肾脏纤维化改变[31]；2）激活肾脏中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）复合物1（mTORC1），促进纤维连接蛋白的表达，引起肾脏纤维化[32]。此外，在STZ诱导的糖尿病小鼠中发现，沉默miRNA21后，可改善小鼠的系膜扩张、肾间质纤维化及巨噬细胞浸润，减少蛋白尿以及抑制肾脏的纤维化和炎性反应基因的表达[33]。

miR29是另一个被广泛研究的miRNAs，miR29家族中包括miR29a、miRNA29b和miR29c3个成员，其所有成员均具有相同的序列并且都可结合到相同的目标基因，在临床试验和动物实验中均发现miRNA29具有抗纤维化作用，还可抑制TGF-β1的转录[34]。在正常肾脏和肺中miRNA29b的表达较高，但当肾脏和肺发生纤维化改变时，miRNA29b的表达明显降低[35-36]。在单侧输尿管梗阻（Unilateralureteralobstruction，UUO）小鼠模型中，肾脏出现纤维化改变，同时miRNA29b的表达降低；而在敲除Smad3的UUO小鼠模型中，肾脏纤维化程度明显减轻，miRNA29b的表达也明显升高，因此Smad3可抑制miRNA29b的表达[36]。由于miRNA29b可直接作用于I/III/IV型胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白的3′端非翻译区，抑制其表达；在糖尿病肾病小鼠模型中，将db/db小鼠过表达miRNA29b后，其蛋白尿明显减少，胶原蛋白和纤维连接蛋白表达减少，肾脏纤维化程度明显减轻[37]。

因此，miRNA21及miRNA29b的表达与DN肾脏纤维化具有密切联系，miRNA21及miRNA29b可作为治疗DN的潜在靶点。在台湾的DN患者中发现，其血清中的miRNA21含量明显高于正常对照组，而miRNA29b含量明显降低；随着疾病的进展，miRNA21的表达逐渐提高，miRNA29b的表达逐渐降低；所以血清中的miRNA21及miRNA29b的含量可作为DN的进展期间的生物标志物[38]。

糖肾方作为临床上治疗DKD的经验方，课题组前期研究已经证明其通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路改善STZ加单侧肾切除大鼠肾脏纤维化[39]。本研究发现，给予糖肾方干预12周后，db/db小鼠肾脏皮质中Smad3的磷酸化程度降低，Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白及mRNA表达的下调，肾脏纤维化明显减轻，表明糖肾方可减轻DN的肾脏纤维化保护肾脏功能。

综上所述，糖肾方可抑制db/db小鼠肾脏TGF-β1/Smad3信号通路的表达，可能通过下调miRNA21的表达，同时上调miRNA29b的表达，显著减轻肾脏纤维化进展保护肾脏功能。

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（2018-05-10收稿責任编辑：张文婷）