糖肾方颗粒不同制备工艺治疗UUO小鼠肾间质纤维化的药效学研究

刘言振 刘鹏 赵婷婷 张浩军 赵海玲 严美花 陈娇伊 李丹丹 孙建波 李平

摘要 目的：利用单侧输尿管梗阻模型小鼠筛选糖肾方颗粒的最佳制备工艺。方法：根据大孔树脂富集、醇提、水提方法设计糖肾方制备工艺1、2、3组。选用C57BL/6小鼠，随机分为假手术组，模型组，工艺路线1、2、3组，阳性药福辛普利组，连续给药6d后，进行单侧输尿管结扎手术。手术后再连续给药7d，检测小鼠血清肌酐和尿素氮，根据MASSON染色半定量分析各组小鼠的肾间质纤维化，根据HE染色进行肾间质细胞浸润评分。结果：各工艺路线组均对UUO引起的小鼠肾病理损伤有一定的改善作用，均显著改善肾间质纤维化，差异有统计学意义（P<0.05），其中工艺路线1、3组作用更佳。工艺路线3组能显著改善小鼠UUO后的血肌酐和尿素氮水平，显著减少肾间质细胞浸润，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：糖肾方颗粒的制备工艺确定为水提工艺。

关键词 糖肾方；肾间质纤维化；制备工艺筛选；UUO

AbstractObjective：Toselecttheoptimalpreparationprocessofsugar-basedkidneygranulesinunilateralureteralobstructionmodelmice.Methods：Accordingtomacroporousresinenrichment，alcoholextractionandwaterextractionmethods，thepreparationprocessofTangshenFormulaI，IIandIIIweredesigned.C57BL/6micewererandomlydividedintoshamoperationgroup，modelgroup，routeI，IIandIIIgroups，andpositivedrugfosinoprilgroup.Sixdaysaftercontinuousadministration，unilateralureteralligationwasperformed.Sevendaysaftersurgery，miceweregivenserumcreatinineandureanitrogenfor7days.SemiquantitativeanalysisofrenalinterstitialfibrosisineachgroupwasperformedaccordingtoMASSONstaining.RenalinterstitialcellinfiltrationscoreswereevaluatedbyHEstaining.Results：EachroutegrouphadacertainimprovementonthepathologicaldamageofkidneyinducedbyUUOinmice，allofwhichsignificantlyimprovedrenalinterstitialfibrosis（P<0.05）.Amongthem，thefirstandthirdgroupsoftheprocessroutehadbettereffects.ThethreeroutescansignificantlyimprovetheserumcreatinineandureanitrogenlevelsofmiceafterUUO，andsignificantlyreducerenalinterstitialcellinfiltration（P<0.05）.Conclusion：ThepreparationprocessofTangshenFormulawasdeterminedasthewaterextractionprocess.

KeyWordsTangshenFormula；Renalinterstitialfibrosis；Preparationprocessscreening；UUO

中圖分类号：R943.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.003

肾间质纤维化（RenalInterstitialFibrosis，RIF）是许多类型肾脏疾病的主要病理基础，造成肾脏功能的不可逆损伤，同时在糖尿病肾病中肾间质纤维化促进病情进展，因此抑制RIF是保护肾脏的有效治疗策略。中医药防治肾间质纤维化有其独特的优势。糖肾方（TangShenFomula，TSF）是本课题组继承前人经验，结合临床实践，以益气养阴、活血通络立法，组方而来。它是由黄芪，生地黄、山茱萸、三七、卫矛、熟大黄、枳壳七味中药组成的复方制剂。临床试验和基础研究证明TSF可以较好的防治糖尿病肾病和改善肾间质纤维化[1-2]。本研究利用经典的单侧输尿管梗阻（UnilateralUreteralObstruct，UUO）小鼠动物模型，对大孔树脂富集、醇提以及水提工艺制备的糖肾方颗粒进行评价，以确定糖肾方最优提取方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物实验选用雄性C57BL/6小鼠，SPF级，8周龄，22～24g，共48只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2007-0001。在中日友好医院动物室屏障系统饲养，许可证号：SYXK（京）2005-0019。实验期间，小鼠自由进食、饮水。

1.1.2药物糖肾方由黄芪、生地黄、三七、大黄、酒山萸肉、鬼箭羽及枳壳7味药组成，草药和最终粉末的原料进行质量控制，符合中华人民共和国2010年药典规定的准则[2]。福辛普利片（蒙诺片）由施贵宝制药有限公司提供，国药准字（1998）第J-57号。

1.1.3试剂与仪器CD-1600全自动生化分析仪（美国，雅培公司），BX-51显微镜（日本，奥林巴斯公司），DP70图形采集系统（日本，奥林巴斯公司），BS224S精密分析天平（德国，赛多利斯公司）。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备48只小鼠按体重随机分为假手术组（sham）、模型组（UUO）、模型+糖肾方工艺1组（TSF-1）、模型+糖肾方工艺2组（TSF-2）、模型+糖肾方工艺3组（TSF-3）以及模型+福辛普利组（Fosinopril）。采用单侧输尿管结扎方法建立单侧输尿管梗阻模型[3]，结扎小鼠左侧输尿管，假手术组小鼠输尿管只游离不结扎。

1.2.2工艺选择工艺路线1：三七、卫矛、麸炒枳壳分别提取后经大孔树脂富集得到提取物①；熟大黄氨水处理后醇沉得到提取物②；黄芪、生地黄采取水提醇沉法得到提取物③；酒山萸肉采取乙醇回流提取工艺得到提取物④；合并提取物①②③④所得。工艺路线2：三七、酒山萸肉、熟大黄、卫矛采取乙醇回流提取，得提取物①；黄芪、生地黄、麸炒枳壳采取水煎煮提取，得提取物②；合并提取物①②所得。工艺路线3：黄芪、生地黄、大黄、酒山萸肉、鬼箭羽及枳壳六味药水煎煮2次，浓缩干燥，三七细粉混合加入过筛，得糖肾方颗粒提取物。

1.2.3给药方法小鼠每日每克生药用量为6.375mg/g/d。由于3种工艺出膏率不同，配置药物浓度为：工艺一药物浓度125.65mg/mL；工艺二药物浓度168.49mg/mL；工艺三药物浓度222.23mg/mL。根据小鼠体重，每天灌胃体积为：0.1mL/10g。福辛普利小鼠用药量为1.5mg/（kg·d），即0.0015mg（g·d）。根据小鼠体重，每天灌胃体积：0.1mL/10g。配置的药物浓度0.15mg/mL。空白组和模型组灌蒸馏水，体积：0.1mL/10g。

1.3标本采集手术后第7天，禁食给水，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，分离血清，摘取肾取中间部分横切后固定在10%中性甲醛溶液中进行组织病理学检查。

1.4检测指标与方法一般状态：密切观察动物毛色，反应性，手术切口愈合情况，有无感染。血生化指标：小鼠血清样本使用全自动血生化分析仪来测定血清高密度脂蛋白胆固醇（High-densityLipoproteinCholes-terol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-densi-tyLipoproteinCholesterol，LDL-C）、肌酐（Creatinine，Cre）、尿素氮（BloodUreaNitro-gen，BUN）。组织病理学指标：肾脏组织用10%的中性甲醛溶液固定24h后，然后乙醇脱水，石蜡包埋后切片，厚度为3μm，分别进行HE染色、Masson染色，光镜下观察小鼠肾组织的病理形态学变化。

1.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学分析，进行单变量方差分析（One-WayANOVA），组间的两两比较选用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠一般状态手术完成后，各组小鼠全部生存，手术切口愈合良好，未见感染征象。各组小鼠活动能力、毛色差异无统计学意义（P>0.05）。

2.23种制备工艺的糖肾方颗粒对UUO小鼠血清肌酐、尿素氮水平的影响与假手术组比，模型组血肌酐和尿素氮显著升高。与模型组比较，糖肾方工艺3组可以显著降低肌酐和尿素氮水平，工艺1组显著降低肌酐水平，工艺2组显著性降低尿素氮水平；阳性药福辛普利的肌酐和尿素氮水平、工艺1组的尿素氮水平以及工艺2组的肌酐水平无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.33种制备工艺的糖肾方颗粒对UUO小鼠肾间质纤维化的影响每只小鼠左肾的Masson染色切片在光镜200倍视野下分别观察8个互不重叠的皮质视野，借助DP70图形采集系统，计算纤维化的面积占全部视野间质面积（排除肾小球、血管所占面积）的百分比值，取其平均值，进行半定量分析。与假手术组比较，模型组纤维化面积显著增多，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，糖肾方3个工艺组和阳性药福辛普利组均能显著改善肾间质纤维化的程度，减轻小鼠肾小管坏死程度，其中以糖肾方工艺三效果最為明显，差异有统计学意义（P<0.05），工艺1次之，工艺2最差。见图2。

2.43种制备工艺的糖肾方颗粒对UUO小鼠肾组织形态学变化的影响在光镜下观察，假手术组左肾均未见明显异常。模型组左肾在镜下可见肾盂扩张，肾实质变薄、皮髓分界不清，肾盏可见斑痕。镜下部分肾小管上皮细胞萎缩，消失，小管扩张；肾间质细胞细胞增多及炎性细胞浸润，基质增多。见图3。

2.53种制备工艺的糖肾方颗粒对UUO小鼠肾间质细胞浸润的影响显微镜下盲法每只小鼠随机取互不重叠的8个视野，按下列标准计量肾脏病理改变并分别进行肾间质细胞浸润情况评分（CellInfiltrationScore，CIS）：间质细胞浸润：无（0分）、局灶细胞浸润（1分）、多灶细胞浸润（2分）、弥漫细胞浸润（3分）；取评分均值代表各样品的肾间质细胞浸润程度。与假手术组比较，模型组小鼠肾间质纤维化炎细胞显著聚集，糖肾方的工艺1和工艺3组及福辛普利组均能够改善肾间质的炎细胞聚集，其中以糖肾方工艺3组改善情况最为显著，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3-4。

2.63种制备工艺的糖肾方颗粒对UUO小鼠血清HDL-C和LDL-C的影响与假手术组比较，模型组HDL-C显著降低。与模型组比较，糖肾方工艺3和福辛普利组均显著升高HDL-C水平，工艺1和工艺2差异无统计学意义。与假手术组比较，模型组LDL-C变化差异无统计学意义（P>0.05），糖肾方3个工艺各剂量和阳性对照药对模型小鼠血清LDL-C水平无显著影响。见图5。

3讨论

糖肾方作为本课题组继承前人经验，结合临床实践组方，用于治疗糖尿病肾病的中药复方，前期开展的动物实验和多中心RCT临床试验已经证实了糖肾方治疗DN疗效确切[1-5]。在单侧肾切合并链脲佐菌素注射诱导大鼠模型中[4]，糖肾方能降低尿白蛋白排泄，改善肾功能；显著减轻模型大鼠的肾间质纤维化水平。

肾间质纤维化不仅是DN的病理基础，也是诸多慢性肾脏病进展至慢性肾衰的必然途径[6]。UUO模型是研究肾间质纤维化的常见模型，高度契合人类肾脏疾病过程，在相对较短的时间跨度内，基本上概括了典型的肾间质损伤纤维化形成的关键特征，是一种较为理想的肾间质纤维化药效学评价模型[7]。本研究采用8周龄雄性C57BL/6小鼠进行UUO手术，7d后出现肾盂扩张、实质变薄、肾小管上皮细胞萎缩、消失，管腔明显扩张、间质炎细胞大量聚集、Masson染色可见大量蓝色胶原纤维增生、肾功下降[8]、脂代谢紊乱[9]等变化，高度吻合以往文献报告的UUO模型病变特点[7]，表明模型建立成功。并在此基础上进行糖肾方不同提取工艺的药效学评价。结果表明工艺3显著改善肾间质纤维化、减少肾间质炎细胞聚集、降低血肌酐和尿素氮水平且显著升高模型小鼠血清HDL-C水平，提示其也有改善脂代谢异常的作用，主要改善了HDL-C水平，LDL-C水平未见明显改变，在之前的研究中也发现了糖肾方能改善脂代谢的作用[10]。工艺1也能改善UUO小鼠的肾功和肾间质损伤，但不及工艺3。可能是因为醇沉工艺除去了相当部分的具有减轻肾间质损伤的活性多糖，如：黄芪中的皂苷、枳壳中的柚皮苷以及地黄中的梓醇[7]、橙皮苷等，使其药效降低有关。研究发现工艺2改善肾损伤的作用不明显，这可能与大黄醇提后有肾毒性蒽醌类[7，11]的溶出增加有关。

综上所述，糖肾方在慢性肾脏病具有多重治疗功效，对肾间质损伤也具有一定的治疗作用，三七干粉加入其余6味药水煎煮提取的工艺3，在改善UUO模型小鼠肾组织病理损害、减少肾间质炎细胞聚集、降低血肌酐尿素氮方面药效显著优于工艺1和工艺2，为最佳提取工艺，故糖肾方颗粒提取工艺确定为三七细粉加入其余全方6味药采取水煎煮提取，为糖肾方进一步的研究奠定了基础。

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（2018-05-10收稿责任编辑：张文婷）