犬子宫蓄脓中绿脓杆菌分离鉴定及耐药性分析

竹堃园，吴兰，刘燕霏，杨建德



犬子宫蓄脓中绿脓杆菌分离鉴定及耐药性分析

竹堃园，吴兰，刘燕霏通信作者，杨建德通信作者

（天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384）

为调查伴侣动物化脓性疾病的致病原因，对来天津农学院附属动物医院就诊的11岁龄母犬蓄脓子宫脓汁进行病原菌的分离、鉴定和耐药性分析。根据分离菌菌落形态观察、涂片染色镜检、生理生化试验、16S rRNA 基因序列分析鉴定结果表明，该分离菌为绿脓杆菌；药敏试验结果显示该分离菌对氨曲南、头孢呱酮、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶、氧氟沙星、链霉素、卡那霉素、呱啦西林和妥布霉素高度敏感，对头孢曲松、头孢呋辛、头孢西叮中度敏感，对氨苄西林、头孢唑林、头孢唑吩、麦迪霉素耐药。研究结果为防治由绿脓杆菌引起的相关感染提供参考依据。

绿脓杆菌；分离鉴定；16S rRNA基因；药敏试验

绿脓杆菌（）又称铜绿假单胞菌（），为革兰氏阴性杆菌假单胞菌属。1882年首先由Gersard氏从伤口脓液中分离得到[1]，为一种对人和动物均具有感染性的条件性致病菌。在兽医临床上，绿脓杆菌可引起多种临床病症：牛乳腺炎、子宫炎，马流产、化脓性肺炎、蛇坏死性口炎、雏鸡败血症等；在人医临床上，绿脓杆菌为常见致病菌，能引起术后及伤口感染，严重时可引发人的胸膜炎、肺炎甚至脑膜炎等[2]。近年来，动物感染绿脓杆菌引发疾病的报道渐多[3-7]。随着生活质量的提高，养伴侣动物的人越来越多，宠物带给人们欢乐的同时，也传播人畜共患疾病，严重威胁着畜主的健康，因此，宠物的健康问题成了人们关注的焦点。细菌是伴侣动物化脓性疾病发病的一个主要原因，本文对一例主要由绿脓杆菌引发的犬子宫蓄脓病例进行研究，以期为防治由绿脓杆菌引起的相关感染提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

天津市天津农学院附属动物医院于2017年9月14日接收的由天津市某畜主畜养的11岁龄母犬子宫蓄脓病例。

1.1.2 试剂

1.1.2.1 培养基：普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基、营养肉汤培养基、血液琼脂培养基。天津农学院实验室自制，制备材料均购自杭州生物研究所。

1.1.2.2 肠杆菌科生化鉴定管：蔗糖、枸橼酸钠、葡磷胨水、甘露醇、麦芽糖、乳糖、靛基质、硫化氢、尿素、半固体琼脂动力生化鉴定管，均购自杭州生物研究所。

1.1.2.3 药敏纸片：氨苄西林、氨曲南、头孢唑林、头孢唑吩、头孢呋辛、头孢呱酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢他啶、头孢西叮、氧氟沙星、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、麦迪霉素、呱啦西林均购自杭州微生物试剂公司。

1.1.2.4 Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；DreamTaq-TM DNA Polymerase购自MBI；dNTP购自生工生物工程（上海）股份有限公司；琼脂糖购自BBI；SanPrep 柱式DNAJ胶回收试剂盒、DNA Ladder Mix maker购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2.5 引物：上游引物5＇-AGTTTGATCMTGGC TCAG-3＇；下游引物5＇-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3＇，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

称取定量配备原料，混匀后定容至1 L，高压蒸汽灭菌，120～125 ℃，15 min。普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基、血液琼脂培养基于超净台倒平板，冷却后置于4 ℃冰箱中保存备用。营养肉汤培养基冷却后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 病料的采集与分离培养

无菌采取该例犬子宫蓄脓病子宫中的脓汁，划线接种于普通营养琼脂培养基，置于37 ℃恒温保温箱中培养24 h后，挑取优势菌落进行纯培养，分别划线接种于普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基、血液琼脂培养基，于37 ℃恒温保温箱中培养24 h后，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 涂片染色镜检

挑取纯培养物单个菌落涂布于载玻片上，革兰氏染色，置生物显微镜低倍镜（4×）下找到视野后，于油镜下观察细菌的形态及染色特征。

1.2.4 生理生化试验

挑取纯培养物无菌接种于营养肉汤培养基，37 ℃恒温保温箱中培养24 h后得到幼龄菌液，于超净台将幼龄菌液分别接种于蔗糖、枸橼酸钠、葡磷胨水、甘露醇、麦芽糖、乳糖、靛基质、硫化氢、尿素、半固体琼脂动力10种肠杆菌科生化鉴定管内，置于37 ℃恒温保温箱中培养24 h后，分析记录结果。

1.2.5 药敏试验

挑取纯培养物无菌接种于营养肉汤培养基，37 ℃恒温保温箱中培养24 h后得到幼龄菌液，于超净台用微量移液器吸取150 mL幼龄菌液于普通营养琼脂培养基表面，“T”型棒涂匀，用镊子无菌夹取17种药敏纸片均匀等距贴于培养基表面，置于37 ℃恒温保温箱中培养24 h后，分析记录结果。

1.2.6 分离菌株 16S rRNA 基因序列的PCR扩增

按SK8255（细菌）试剂盒操作说明书提取该菌基因组DNA。以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，预扩增条带为1 500 bp。扩增体系为：Template（基因组DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，酶0.2 μL，F（10 μmol/L） 0.5 μL，R（10 μmol/L）0.5 μL，加双蒸H2O至25 μL。PCR循环条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72 ℃恢复延伸10 min，4 ℃终止反应。PCR产物进行1%琼脂糖电泳，150 V、100 mA、20 min电泳观察。最终送生工生物工程（上海）股份有限公司纯化、测序。测序引物为：5＇-AGTTTGATCMTGGCTCAG - 3＇；5＇-GGTTACCTTGTTACGACT T-3＇。

1.2.7 分离菌株16S rRNA基因序列同源性分析与系统发育树构建

16S rRNA基因序列在NCBI网站进行BLast比对，获取与分离菌株最为相近的序列，在DNAstar软件上进行多序列同源性比对、分析，最后构建系统发育树。

2 结果

2.1 菌落培养形态特征

在普通营养琼脂培养基上形成浅绿色、圆形、光滑湿润、边缘呈波状的中等大小菌落；培养基也呈黄绿色，数日后，培养基的绿色逐渐变深（图1）。麦康凯培养基上形成外周透明中间浅灰色，大头针顶大的圆形菌落。血液琼脂培养基上形成灰色，中心较暗，呈β溶血的不规则圆形大菌落（图2）。

图1 分离菌普通营养琼脂平板培养图

图2 分离菌血液琼脂平板培养图

2.2 涂片染色镜检

油镜下可见到单在、成对或者连接呈短链状中等大小的革兰氏染色阴性杆菌（图3）。

图3 分离菌显微镜下观察结果

2.3 生理生化试验结果

对该菌进行生化试验，结果见表1，该分离菌株不分解蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇；不产生靛基质；不利用尿素；MR、VP试验均呈阴性；能利用枸橼酸钠；产生硫化氢。参照标准菌株生理生化特性，该分离菌与绿脓杆菌基本一致，初步判定该分离菌为绿脓杆菌。

表1 生化试验结果

注：“＋”阳性；“－”阴性

2.4 药敏试验结果

对该菌进行药敏试验结果见表2，根据CLSI药敏试验标准，分为耐药（R）、中度敏感（I）、高度敏感（S）。结果表明该分离菌对氨曲南、头孢呱酮、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶、氧氟沙星、链霉素、卡那霉素、呱啦西林、妥布霉素高度敏感，对头孢曲松、头孢呋辛、头孢西叮中度敏感，对氨苄西林、头孢唑林、头孢唑吩、麦迪霉素耐药。

表2 药敏试验判定结果

注：“R”耐药；“I”中度敏感；“S”高度敏感

2.5 分离菌株16S rRNA 基因序列的PCR扩增

分离菌16S rRNA基因序列的PCR扩增电泳显示该菌的基因扩增片段长度约为1 480 bp，预扩增片段长度为1 500 bp，与预期片段长度一致。

2.6 分离菌株16S rRNA基因序列同源性分析

分离菌经测序获得的基因序列在NCBI网站上进行BLast比对，获取13株相近参考序列。将分离菌株16S rRNA基因序列经DNAStar软件中的Megalign分别与该13株16S rRNA 基因序列进行同源性分析。结果表明，分离菌株的16S rRNA基因序列与该13株绿脓杆菌的16S rRNA基因序列具有极高的同源性，同源性均在99%以上，见图4。

图4 16S rRNA基因序列与参考序列同源性比较结果

2.7 分离菌珠系统发育树的构建

将分离菌株的16S rRNA基因序列经DNAStar软件中的Megalign与13株相近序列通过Neighbor-Joining法进行进化树构建。由进化树分析得分离菌株与KX268504.1的亲缘性最近，而与数据库中的MG585077.1、KM894176.1亲缘性相对较远，见图5。

图5 16S rRNA基因序列与参考序列构建进化树结果

3 讨论

绿脓杆菌是一种人兽感染的重要条件致病菌，可感染包括人在内的多种动物。伴侣动物与人类共享一个生活环境，它们或是易感，或是在疾病传播中发挥作用[8]。本次研究，分离菌落在普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基、血液营养琼脂培养基上的生长形态特征及革兰氏染色镜检结果与韩青松等研究报道中提到的绿脓杆菌形态和培养特征一致[9]。生理生化试验结果与牛钟相等研究报道中提到的绿脓杆菌生化特性一致[1]。16S rRNA基因测序是目前用于鉴定菌株种类的最普遍的分子技术[10]，分离菌16S rRNA 基因分子序列与参考绿脓杆菌16S rRNA基因分子序列同源性高达99%，结合菌落形态观察、涂片染色镜检、生理生化试验、16S rRNA 基因序列分析鉴定最终将该分离自犬子宫蓄脓病子宫脓汁中的菌株判定为绿脓杆菌。

此次药敏试验结果表明，该分离菌对氨曲南、头孢呱酮、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶、氧氟沙星、链霉素、卡那霉素、呱啦西林、妥布霉素高度敏感，但对头孢曲松中度敏感，对氨苄西林、头孢唑林、头孢唑吩、头孢呋辛、头孢西叮、麦迪霉素耐药。这与吴文德等报道的眼镜蛇腐皮病病原菌第1、15号菌对该17种药物的药敏试验结果基本一致[3]，只有对头孢曲松、氧氟沙星、卡那霉素的耐药性发生了变化，这可能与该犬前期诊断用药或试验误差有关。根据试验结果，可选择敏感性极高的头孢呱酮、头孢噻肟为治疗药物。由药敏试验结果可知其耐药性广泛，这与张祎博等报道的2005—2014年CHINET铜绿假单胞菌耐药性检测结果一致[11]。很多因素导致了细菌对抗生素的耐药性，在兽医临床上主要是抗生素的不合理使用或滥用[4]。绿脓杆菌对抗生素的敏感性总体上呈逐年下降的变化趋势[12]。因此，对该菌的耐药性检测是临床用药的重要参考指标，为使绿脓杆菌病得到快速有效的治疗及延缓耐药性的产生，兽医临床上不仅需要根据耐药性检测结果选择最有效的治疗药物，还需要严格控制抗生素的使用，避免同一抗生素的长期使用。

伴侣动物化脓性疾病为兽医临床上常见疾病，病灶区含有多种人畜共患病原菌，人类一旦接触此类携带人畜共患病原菌的患病动物而不注意消毒卫生，就可能引起发病。有报道表明，犬发情后期，黄体大量分泌孕酮，这时母犬子宫对细菌感染最为敏感[13]。受孕酮浓度增加和雌激素浓度降低的影响，子宫免疫力下降，犬发情后期经开张的子宫颈进入子宫的致病菌，此时极易大量增殖，导致子宫内膜炎，最终引起子宫蓄脓[14]。因此，本例犬子宫蓄脓疾病判断病因为犬发情后期在孕酮和雌激素的预作用下，铜绿假单胞菌在子宫内大量滋生造成的。临床上子宫蓄脓病例分离到的细菌主要是大肠杆菌[15]，此外还有肺炎克雷伯氏菌、链球菌、粪肠球菌、假单胞杆菌、葡萄球菌等[16-17]，对绿脓杆菌引起的子宫蓄脓报道较少，此次研究丰富了绿脓杆菌的研究数据，也为防治由该菌引起的相关感染提供参考。为了降低动物及人的受感染概率，畜主应当定期做清洁工作，严格接种疫苗，发病后及时接受治疗。

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责任编辑：张爱婷

Isolation, identification and susceptibility analysis offrom a canine pyometra

ZHU Kun-yuan,WU Lan, LIU Yan-feiCorresponding Author, YANG Jian-deCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to clarify the causes of the fester disease in companion animals, the study involved isolation, identification and drug susceptibility analysis of pathogenic bacteria from an 11-year-old female dog’s uterus who were admitted to the veterinary hospital of Tianjin Agricultural University. According to the results of colony morphology, smear staining microscopy, physiological and biochemical reaction and 16S rRNA gene analysis, the bacteria was identified as a. Susceptibility analysis showed that the isolate is highly sensitive to aztreonam, cefdinir, cefotaxime, cefepime, ceftazidime, ofloxacin, streptomycin, kanamycin, piperacillin and tobramycin. Moreover, this isolate is moderately sensitive to ceftriaxone, cefuroxime and cefoxitin, but resistant to ampicillin, cefazolin, cefazine and medemycin. The research results provided references for controlling infection caused by.

; isolation and identification; 16S rRNA gene; susceptibility analysis

1008-5394（2018）03-0047-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.010

S852.611

A

2018-03-26

天津农学院大学生创新创业项目（201710061193）；天津自然科学基金项目（07JCYBJC16000）

竹堃园（1996-），女，本科在读，研究方向：预防兽医学。E-mail：824771063@qq.com。

刘燕霏（1970-），女，副教授，硕士，研究方向：预防兽医学。E-mail：674383573@qq.com。

杨建德（1969-），男，教授，博士，研究方向：预防兽医学。E-mail：jiandeyang@126.com。