不同比生长速率对毕赤酵母发酵生产植酸酶的影响

赵凯， 葛菁华， 王海

(青岛蔚蓝生物集团有限公司，山东 青岛 266101)

植酸酶作为一种高效的饲料添加剂，在动物体内可以帮助其降解植酸盐，改善磷和其他养分的消化吸收，减少养分排泄，提高磷的利用率，增加养殖户的经济效益，同时对降低植酸磷对环境的污染有重要作用。目前，养殖业对植酸酶的需求越来越大，同时更加关注其成本。因此，提高植酸酶表达量，降低发酵成本成为植酸酶研究、生产的当务之急。

毕赤酵母植酸酶发酵工艺优化的研究已有很多报道。李洪淼等[1]对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵条件进行了实验，并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料方式的研究。黄魁英等[2]对植酸酶毕赤酵母基因工程菌PEY-2的发酵条件进行了研究。郭美锦等[3]对重组毕赤酵母表达工程植酸酶过渡相参数进行了分析研究。闵兆升等[4]采用单因素试验和正交试验考察了不同工艺条件对毕赤酵母工程菌H311产植酸酶的影响。王兴吉等[5]对毕赤酵母H工程菌30 L发酵产植酸酶的发酵条件及该酶的热稳定性进行了研究。

1 研究方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

重组毕赤酵母基因工程菌(Mut+)，由本公司自行构建，分泌表达植酸酶。

1.1.2 培养基

种子培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基，发酵培养基为基础盐(BSM)培养基(用葡萄糖替换甘油)。

1.2 方法

1.2.1 种子培养

将保藏菌种接种到50 mL的YPD培养基中培养18～24 h，再按照10 %接种量接种YPD培养基扩培16～24 h，然后按照8 %接种量接入发酵罐BSM培养基中发酵培养。

1.2.2 发酵控制

流加氨水控制pH 4.5，底糖耗尽后通过流加含12 mL/L 微量盐(PTM1)培养基的60 %的葡萄糖增加湿重，控制相同湿重(180 g/L左右)开始诱导，根据实验需求和测量的湿重控制不同比生长速率(μ)0.01 h-1、0.015 h-1、0.02 h-1进行相应的甲醇补料诱导植酸酶表达。每隔8 h或16 h取样测湿重，然后调节甲醇补料量为湿重与比生长速率乘积。

1.2.3 分析方法

细胞湿重测定：10 mL发酵液10 000 r/min离心10 min后弃上清称重；植酸酶酶活测定：GB/T 18634—2009饲用植酸酶活性的测定分光光度法[12]。

2 结果与讨论

2.1 对照实验

发酵液底料中含有30 g/L葡萄糖，葡萄糖耗尽之后DO回升，此时开始流加60 %的葡萄糖直至诱导所需湿重180 g/L(大约发酵时间24 h时)，之后停止流加葡萄糖，饥饿30 min左右，开始流加甲醇诱导产酶。对照组甲醇流加策略参照Invitrogen毕赤酵母发酵手册[13]进行控制，速度从1 g/(L·h)开始，每两小时提高0.5 g/( L·h)，直到甲醇流加速度为4.5 g/(L·h)时，停止继续提高，并以该流速至发酵结束。

由图1可知，发酵40 h时(大约诱导后15 h左右)，湿重186 g/L，酶活691 U/mL，随后酶活和湿重随发酵时间增加，发酵144 h时湿重出现轻微下降，最后两个取样点酶活基本相同，至发酵168 h时下罐，此时湿重408 g/L，酶活10 282 U/mL。

图1 对照酶活湿重曲线Fig.1 Enzyme activity and wet cell weight profile of the control group

2.2 比生长速率为0.01 h-1时的产酶状况

甲醇诱导产酶之前的过程同2.1。甲醇流加速度从1 g/(L·h)开始，按照0.01 h-1乘以相应的湿重(每8 h或16 h取样测湿重，然后进行相应的甲醇流速调节)所得的速度进行甲醇补料。

由图2可知，发酵40 h时，湿重192 g/L，酶活583 U/mL，随后酶活和湿重随发酵时间增加，酶活168 h时出现轻微下降，至发酵168 h时下罐，此时湿重457 g/L，酶活11 763 U/mL。以0.01 h-1的比生长速率进行甲醇流加，发酵最终消耗甲醇5.3 L，而对照组甲醇消耗6.2 L，尽管甲醇消耗比对照少14.5 %，但是酶活却比对照高14.4 %。

图2 比生长速率0.01 h-1时酶活湿重曲线Fig.2 Enzyme activity and wet cell weight curve at specific growth rate adjusted to 0.01 h-1

2.3 比生长速率为0.015 h-1时的产酶状况

甲醇诱导产酶之前的过程同2.1。甲醇流加速度从1 g/(L·h)开始，按照0.015 h-1乘以相应的湿重(每8 h或16 h取样测湿重，然后进行相应的甲醇流速调节)所得的速度进行甲醇补料。

由图3可知，发酵40 h时，湿重185 g/L，酶活423 U/mL，随后酶活和湿重随发酵时间增加，144 h时湿重出现下降，至发酵168 h时下罐，此时湿重482 g/L，酶活13 644 U/mL。以0.01 h-1和0.015 h-1的比生长速率进行甲醇补料，中前期酶活和对照相当甚至比对照低，但是随着发酵进行，菌体湿重增大，甲醇流加量增大，最终发酵酶活都超过对照组。

图3 比生长速率0.015 h-1时酶活湿重曲线Fig.3 Enzyme activity and wet cell weight curve at specific growth rate adjusted to 0.015 h-1

2.4 比生长速率为0.02 h-1时的产酶状况

甲醇诱导产酶之前的过程同2.1。甲醇流加速度从1 g/(L·h)开始，之后按照0.02 h-1乘以相应的湿重(每8 h或16 h取样测湿重，然后进行相应的甲醇流速调节)所得的速度进行甲醇补料。

由图4可知，发酵40 h时，湿重190 g/L，酶活712 U/mL，随后酶活和湿重随发酵时间一直增加，至发酵168 h时下罐，此时湿重524 g/L，酶活17 445 U/mL。以0.02 h-1的比生长速率进行甲醇补料时，酶活一直比对照和其他两个实验组高，可以推断前期菌体适应甲醇后，在一定范围内，甲醇量越高对产酶越有利。而以0.02 h-1的比生长速率进行甲醇流加，最终酶活比对照提高69.7 %，因此，以合适的比生长速率控制甲醇流加，可能会引起菌体代谢流的改变，更多的代谢能量和物质流向产酶通路。

图4 比生长速率0.02 h-1时酶活湿重曲线Fig.4 Enzyme activity and wet cell weight curve at specific growth rate adjusted to 0.02 h-1

由图5可知，随着底糖消耗DO逐渐降低，至16 h左右，底糖耗尽，DO回升，随之开始补糖流加，至发酵24 h左右湿重达到180 g/L，停糖饥饿30 min，此时DO大幅回升，然后按照1 g/(L·h)的速度流加甲醇3 h，之后按照各自甲醇流加策略分别进行甲醇流加。发酵中期DO水平与甲醇流加量相关，甲醇流加量大，DO水平低，而发酵后期DO基本都跌零，但是通过对发酵液进行液相检测，甲醇几乎没有残留。

图5 不同比生长速率下的溶氧量曲线Fig.5 Time course of dissolved oxygen at different specific growth rates

3 结论

以不同的比生长速率进行甲醇流加补料，发酵酶活均比对照提高。以0.01 h-1，0.015 h-1，0.02 h-1比生长速率进行甲醇补料，酶活分别提高14.4 %，32.7 %，69.7 %。以比生长速率指导甲醇补料，既可以提高甲醇的利用率，又可以提高酶活力，从而降低发酵成本。受取样时间的限制，本文根据比生长速率进行甲醇流速调整的时间间隔为8 h或16 h，如果利用可以在线检测菌体密度的发酵反应器，根据测得的菌体密度在线实时反馈调节甲醇流量，可能会得到更优的结果。随着比生长速率的提高，酶活提高越多，在DO允许的情况下，继续提高比生长速率可能会更大地提高产酶量，而受反应器及DO的限制，本文得到的最适比生长速率为0.02 h-1。