超高效液相色谱-质谱法测定四君子汤含药血清中人参皂甘Rg1、Re、Rb1的含量

尚如霞 徐卫东（通讯作者） 谢超

（1镇江市食品药品监督检验中心 江苏 镇江 212000）（2江苏大学 江苏 镇江 212000）

四君子汤为中药传统的健脾基础方，对肝纤维化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的临床疗效。四君子汤组方为人参、甘草、白术、茯苓，其发挥主要功效的为人参。人参皂甘Rg1、Re、Rb1为人参的代表性成分，也是四君子汤含药血清成分测定的目标。本文建立一种专属、灵敏、准确、操作简便的超高效液相色谱-质谱联用方法，用于四君子汤含药血清中人参皂甘Rg1、Re、Rb1的同时测定。

1.实验材料

1.1 药品、对照品与试剂

人参：亳州市京皖中药饮片厂，产地：吉林，批号：161001，中国。

白术：安徽井泉中药股份有限公司，产地：浙江，批号：20170801，中国。

茯苓：安徽惠隆中药饮片有限公司，产地：安徽，批号：20170701，中国。

炙甘草：安徽和济堂中药饮片有限公司，产地：内蒙，批号：20170901，中国。

对照品：人参皂甘Rg1(110704-201726)、人参皂甘Re(110703-201731)、人参皂甘Rb1(110754-201726)，均购自中国药品生物制品检定所。

1.2 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，体重180～200克，由江苏大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（苏）2009-0002。

1.3 实验仪器

岛津LCMS-8050三重四级杆质谱仪

岛津DGU-20A高效液相色谱仪

赛多利斯天平Secura 225D-1CEU

2.实验方法

2.1 四君子汤水提物的制备

按四君子汤处方,等比例分别称取人参（9g）、白术（9g）、茯苓（9g）、炙甘草（6g）药材，加水10倍浸泡3h，煎煮2次（第1次8倍量，第2次6倍量），每次1h，分离药渣，保留药液，将所有药液混匀浓缩至0.4g·ml，合并滤液，4℃冰箱储存备用。

2.2 药物血清制备

选择SD大鼠连续灌胃7天（每天2次），对照组给予蒸馏水，给药剂量为临床成人剂量*70*0.018/大鼠体重，在采血前禁食不禁水12h以上，末次给药后2h麻醉心脏取血，静置30min，离心（2000转/分）10min，分离血清。血清用0.2µm微孔滤膜除菌，-70℃冰箱储存备用。

2.3 含药血清的处理

随机取两只大鼠血清，约4ml，加入20ml甲醇快速混匀震荡，密闭超声提取15min，3000转/分离心10min，取得上清液后于40℃恒温条件下减压回收，干燥后残渣以1ml甲醇溶解，0.45µm滤膜过滤，进样分析。

2.4 分析条件

色谱条件：shim-pack GIST C18色谱柱（150mm×2.1mm,2μm）；流动相A：水，B：乙腈；流速：0.3mL·min-1；柱温：20℃；样品室温：4℃；进样量：3µl，梯度洗脱条件如表1所示。

表1 梯度洗脱条件

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；喷雾电压：4KV；负离子检测；鞘气（N2）流速：3L/min；辅助气（N2）流速：10L/min；毛细管温度：300℃。采用全离子扫描方式，扫描范围m/z：100～1200，碰撞气体为氦气。

3.实验结果与讨论

3.1 分析方法的建立

3种皂苷一级质谱丰度最高的离子峰是[M+Na］+，有少量［M+H］+和［M+K］+，子离子扫描质谱图见图1～3，检测方式为正离子多离子反应监测（MRM），用于定量分析的离子为m/zRg1823.6→643.4；Re969.5→ 789.4；Rb11132.0→ 364.8；定性分析的离子为m/zRg1823.6→203.2；Re969.5→203.15；Rb11132.0→365.2。所用的色谱条件使被分析的化合物在17～30min内被洗脱出来（图4），人参皂苷Rg1、Re、Rb1的保留时间分别约为17.9、18.0、29.9min，以保留时间和各对离子的响应强度的比例作为定性分析标准，使方法的专属性更强，有效避免了血浆内源性物质对测定的干扰。

3.2 标准曲线

取空白血清0.5ml,加入人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照溶液，配制成浓度为0.5、5、10、25、50、100、1000ng·ml-1系列标准血清样品，按2.1血清制备方法处理后，进样分析，以测得的峰面积Y对血药浓度X作直线回归，线性关系良好，标准曲线回归方程分别为：Rg1Y＝15502X+618，r=0.99998；Re Y＝6037X+1194，r=0.99995；Rb1Y＝65X-605，r=0.9996；定量下限达到0.5ng·ml-1。

图1 人参皂苷Rg1的子离子扫描质谱图

图2 人参皂苷Re的子离子扫描质谱图

图3人参皂苷Rb1的子离子扫描质谱图

3.3 精密度和回收率

取空白血清0.5ml，配制成5、50、1000ng·ml-1浓度的样品血清，按2.1血清制备方法处理后，每个浓度5份样品同时测定，计算其标准偏差RSD%为精密度；将样品血清测得的色谱峰面积与空白血清提取后加入人参皂苷Rg1、Re、Rb1对准品溶液后测得的峰面积相比，考察方法的相对回收率，结果见表2。

表2 精密度和回收率

3.4 稳定性

样品血清经3次反复冻融和-20℃保存3天仍保持稳定；常温下放置12h后仍保持稳定，其稳定性可以满足测定方法的要求。

3.5 样品血清测定结果

取5只大鼠血清，按照2.2方法进行处理后进样，测得结果见表3。

表3 样品血清测定结果

3.6 讨论

在临床上，四君子汤对肝纤维化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的临床疗效。但四君子汤对肝干细胞的作用机制何在，目前尚未阐明。通过对四君子汤含药血清的研究，检测出其中人参皂苷的三种即Rg1、Re、Rb1，由于它们在紫外区203nm有末端吸收，且血清中杂质也会有干扰，采用普通HPLC法测定灵敏度和专属性较差。本文建立的UPLC/MS/MS方法灵敏度高，结果准确，重现性好，操作简便快速，符合生物样品分析的要求，测定出了四君子汤含药血清中人参皂苷Rg1、Re、Rb的含量，进一步阐明了人参为四君子汤发挥作用的主要物质基础。