丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏IR的调节作用*

刘东慧，李东哲，张祥云，宋妤轩，宋成军△，陈志宏△

（1.承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000；2.河北省军区承德离职干部休养所）

胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要特征，产生胰岛素抵抗的重要原因之一是信号转导障碍[1]。在肝脏，胰岛素主要通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路调节糖类代谢[2]。而胰岛素受体(insulin receptor，IR)是PI3K/Akt信号通路的重要介导者[3]。

目前，用于糖尿病治疗的各类西药虽然均有明显降低血糖的作用，却不能有效改善胰岛素抵抗，且长期服用易引发不良反应。丝胶是蚕茧中的一种天然高分子水溶性蛋白，本研究在前期研究发现丝胶可有效降低2型糖尿病大鼠血糖[4]的基础上，通过观察大鼠肝脏IR表达的变化来探讨丝胶降血糖的作用机制，以期为开发治疗糖尿病的天然药物提供新思路。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；PrimeScript RT Master Mix，Premix Taq酶 ，SYBR Premix Ex TaqⅡ(宝生物工程(大连)有限公司)；质粒小提试剂盒，pGM-T克隆试剂盒，DH5α感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)；琼脂糖凝胶切胶回收试剂盒(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)；丝胶，从承德医学院桑蚕研究所提供的彩色蚕茧中提取后干燥成粉末储存备用，灌胃前用生理盐水溶解至相应浓度。

1.2 实验动物分组及处理将购自北京维通利华实验动物技术有限公司的36只SPF级雄性SD大鼠（合格证号：SCXK(京)2012-0001）随机分为正常组、模型组和实验组，每组12只。采用高脂高糖饲料喂养+腹腔注射STZ(35mg/kg，1次/d，连续2次)的方法建立2型糖尿病大鼠模型，以注射STZ后72h空腹血糖≥11.1mmol/L作为成模标准[5]。成模后，实验组大鼠给予丝胶(2.4g/kg/d)连续灌胃35d，其它组大鼠给予生理盐水灌胃35d。灌胃结束，各组大鼠禁食12h后麻醉(腹腔注射10%水合氯醛)、取血、处死，迅速取肝脏入液氮保存。所有动物实验均依据承德医学院规定的伦理准则进行。

1.3 检测大鼠血糖水平将所取血液离心、分离血清后用葡萄糖氧化酶法检测血糖水平。

1.4 检测大鼠肝脏IR mRNA的表达采用Real Time Q-PCR法：取100mg肝脏组织提取总RNA，测定RNA的含量、纯度及完整性并反转录为cDNA。采用pGM-T质粒载体构建IR和内参GAPDH标准品用以后续定量。利用Real Time Q-PCR法扩增IR和内参GAPDH，得到标准曲线、扩增曲线和溶解曲线。PCR引物序列见附表。分别以各组样品IR拷贝数与相应内参GAPDH拷贝数的比值作为IR mRNA的相对表达水平。

附表 引物序列和产物大小

1.5 实验数据的统计分析实验数据均以(±s )表示并采用SPSS 19.0统计学软件分析处理，多组间差异的比较采用单因素方差分析，两两组间差异采用Tukey’s检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖水平模型组大鼠的血糖为(29.45±4.82)mmol/L，明显高于正常组大鼠(10.83±2.03)mmol/L(P＜0.0 5)；实验组大鼠的血糖为(13.20±4.09)mmol/L，明显低于模型组大鼠(P＜0.05)。

2.2 各组大鼠肝脏IR mRNA的表达以pGM-T-IR阳性质粒DNA(浓度梯度：1.45×108-1.45×104)和样品cDNA做为模板，经过Real Time Q-PCR法扩增后得到扩增曲线(均呈典型的S型，且样品扩增曲线均在标准曲线范围内)、溶解曲线(呈单峰，表明产物单一，无非特异性扩增)和标准曲线(斜率为-3.262，相关系数r为-0.991，截距为42.298，扩增效率为102.537%)，扩增曲线、溶解曲线、标准曲线见附图。

IR mRNA定量分析结果：模型组大鼠IR mRNA相对表达量为(28.83±8.06)，明显低于正常组大鼠(58.14±16.39)(P＜0.05)；实验组大鼠IR mRNA相对表达量为(46.37±12.57)，明显高于模型组大鼠(P＜0.05)。

附图 Real Time Q-PCR检测各组大鼠IR mRNA的表达

3 讨论

目前，随着人们生活水平的提高及生活方式的改变，2型糖尿病的发病率、患病率正急剧上升。国际糖尿病联盟2017年的调查结果显示，全球糖尿病成人患者已达4.25亿，预计2040年，全球糖尿病患病人数将达6.42亿，其中2型糖尿病患者占据绝大部分[6]。目前，2型糖尿病已成为世界范围内严重威胁人类健康的公共卫生问题。因此，亟需寻求一种降糖效果可靠且不良反应少的糖尿病治疗药物。

丝胶是蚕茧中包被在丝素周围的一种天然高分子水溶性蛋白，主要由18种氨基酸组成，具有生物相容性，可生物降解。同时，近年来研究发现丝胶还具有抗肿瘤、抗氧化、促进脑神经发育和冷冻保护等多方面的作用[7]。我国民间早有蚕茧泡水降血糖的验方，本课题组前期研究亦发现丝胶具有良好的降血糖作用，但具体作用机制尚不明确。

IR是由两个α亚基和两个β亚基通过二硫键连接而成的一种大分子跨膜糖蛋白。在肝脏，胰岛素要发挥调节糖代谢的正常生理功能，首先要与肝细胞膜表面IR的α亚基结合，引发β亚基的酪氨酸残基自身磷酸化后才能激活下游的相关因子而启动PI3K/Akt信号通路[8]，因此IR作为胰岛素PI3K/Akt信号通路的起始因子，在调节胰岛素的代谢效应中具有十分重要的作用。

本研究发现，与正常组相比，模型组大鼠肝脏IR mRNA的表达水平明显降低，结果与钱俊文等[9]的胰岛素抵抗机理研究结果一致，即IR是肝脏胰岛素PI3K/Akt信号通路的重要介导者，其基因突变或表达下调均可造成肝细胞膜表面IR数目减少，从而降低胰岛素敏感性而引发胰岛素抵抗。而用丝胶蛋白对2型糖尿病模型大鼠进行灌胃治疗后发现，实验组大鼠肝脏IR mRNA的表达明显升高，提示丝胶可能通过提高IR的表达水平增强胰岛素PI3K/Akt通路的转导效应，进而通过促进葡萄糖转运、肝糖原的合成及加强对糖异生的抑制作用起到降低血糖的效果，这可能是丝胶降低血糖的作用机制之一。