GLP-1重组减毒沙门菌治疗对2型糖尿病小鼠的Caveolin-1及胰岛β细胞自噬相关因子的影响

高芸 康林 祝莹 黄瑾

(雅安市人民医院干部内科, 四川 雅安 625000)

胰高血糖素样肽-1(GLP-1，Glucagon like peptide-1)是人体内重要的激素，主要由小肠L细胞合成并分泌，可有效作用于胰岛β细胞，促进释放胰岛素，实现有效控制机体内胰高血糖素水平[1]。人体内GLP-1可有效改善氧化应激和炎症损伤，有效保护胰岛细胞，并可有效抑制胰岛细胞凋亡和氧化[2]。现阶段，临床常采用皮下注射方式进行GLP-1类药物治疗，因而常导致患者长期治疗依从性较差。近年，基因治疗日益成为临床新兴的治疗手段，其可特异性编码某种蛋白质，并利用口服灌胃方式将重组表达载体置入体内，可有效实现在宿主细胞内表达基因，起到治疗和预防疾病的作用[3]。一般情况下，由于减毒沙门菌可通过肠壁M细胞到达Peyer淋巴结，可在肠系膜相关淋巴组织中进行定位，并经淋巴结侵袭达脾脏、肝脏等肿瘤组织和器官，有效刺激呈递基因、机体免疫等作用[4]。既往研究结果显示，结肠癌、黑色素瘤、肺癌及胃癌等患者采用重组减毒沙门菌治疗具有较高临床疗效[5]。但现阶段GLP-1重组减毒沙门菌的应用仍鲜有报道。本研究采用GLP-1重组减毒沙门菌对2型糖尿病小鼠干预，分析GLP-1重组减毒沙门菌治疗对2型糖尿病小鼠的Caveolin-1、胰岛β细胞自噬相关因子的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选取40只SPF级昆明种健康清洁级4周龄小鼠，分为正常组、对照组、空载组及治疗组，每组各10只。所有小鼠均在SPF级实验条件喂养，所有小鼠、饲料及垫料均购买自南京大学模式动物中心，自由摄食及饮水，环境温度24～26 ℃，本研究经雅安市人民医院动物伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器与试剂 本组研究中所用血糖仪购买自美国强生公司，链脲佐菌素(STZ，Streptozotocin)购买自美国Sigma公司。

1.2.2 质粒于菌株 GLP-1蛋白质粒pcDNA3.3-GLP1、减毒沙门氏菌菌株Ty21a控pcDNA3-flag均购买自上海生工生物有限公司。

1.2.3 重组减毒沙门菌构建 本组研究中使用构建好的质粒制备减毒沙门菌感受态，将50μL减毒沙门菌感受态细胞及1μL质粒置于电击杯中，后将参数设定为0.8 ms，2399V进行电转化。电转成功后挑选单克隆菌种，提取DNA扩增，后行鉴定。鉴定成功后涂板，过夜挑选菌种，鉴定克隆菌中是否存在GLP-1基因。

1.2.4 造模及分组造模 小鼠适应性喂养一周后，将小鼠分为造模30只，10只正常培养作为正常组。造模小鼠给予60%高脂饲料，正常组小鼠给予10%低脂对照饲料，均辐照饲料，定时更换鼠水、鼠笼及饲料，4周后过夜禁食，空腹12小时以上，称量空腹体质量并记录，后空腹注射STZ(65 mg/kg)，72小时后，使用微量血糖仪检测空腹血糖，血糖≥11.1mol/L则判定为造模成功，成功后分为对照组、空载组及治疗组。

1.2.5 重组减毒沙门菌干预 造模成功120小时后进行干预，正常组每组灌胃100 μL 5% NaHCO3溶液、对照组每组灌胃100 μL 5% NaHCO3溶液、空载组每只灌胃100 μL pcDNA3减毒沙门菌，菌液浓度109/mL、治疗组每只灌胃100 μL pcDNA3-GLP-1减毒沙门菌，菌液浓度109/mL，所有组别均治疗28天。

1.3 检测指标 在造模前、造模成功后及治疗结束后进行眼眶取血0.5 mL，使用血糖仪检测血中血糖水平。在治疗结束后使用水合氯醛麻醉后断头处死，冰上解剖并分离胰腺组织，使用液氮保存并标记。取胰腺组织分成两块，使用RIPA裂解液提取总蛋白，后使用Western Blot法检测Caveolin-1及β-actin水平，并使用Caveolin-1/β-actin表示Caveolin-1水平。取另一块胰腺组织使用RT-PCR法检测β胰岛细胞中Atg3、Atg12及Beclin1 mRNA水平，本组研究反应体系26.5 μl，其中上下游引物各1μl(5 μmol/L)，Sybr Premix Ex Taq 13 μl，cDNA 2.5 μl，灭菌水9 μl，选择GAPDH作为管家基因，计算各mRNA相对表达量。所用试剂盒购买自罗氏公司，见表1。

表1 引物表Table 1 The primers

2 结果

2.1 治疗前后各组血糖水平检测结果 治疗后治疗组小鼠血糖水平显著低于对照组及空载组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 治疗前后各组血糖水平检测结果Table 2 Blood glucose levels before and after treatment

注：治疗组与对照组、空载组比较，①P<0.05

2.2 治疗后各组胰岛Caveolin-1水平检测结果 治疗后，治疗组小鼠胰岛Caveolin-1水平显著高于对照组及空载组，差异有统计学意义(P<0.05)，对照组及空载组Caveolin-1水平无明显差异(P>0.05)，见表3。

表3 治疗后各组Caveolin-1水平检测结果Table 3 Caveolin-1 levels after treatment

注：治疗组与对照组、空载组比较，①P<0.05

2.3 治疗后各组自噬相关因子表达水平检测结果 治疗后,治疗组小鼠胰岛Atg3、Atg12及Beclin1水平显著低于对照组及空载组(P<0.05)，对照组及空载组Atg3、Atg12及Beclin1水平无明显差异(P>0.05)，见表4。

表4 治疗后各组自噬相关因子表达水平检测结果Table 4 levels of autophagy related factors after treatment

注：治疗组与对照组、空载组比较，①P<0.05

3 讨论

随着我国人民生活水平不断提高，人口老龄化趋势的不断加重，膳食结构不断改变，我国2型糖尿病的临床发病率逐渐增加，且存在诸多糖尿病前期患者，因此，2型糖尿病的临床及日常防治趋势日益严峻。有研究显示，在2型糖尿病的发生及发展过程中，胰岛素功能障碍及胰岛素抵抗起到十分重要的作用，在发病过程中可能伴有胰岛细胞凋亡、持续性损害及胰岛功能衰退[6]。一般情况下，在对2型糖尿病患者进行治疗时侧重于控制血糖水平，但并未有效控制糖尿病的症状及多种并发症，且无法实现从根本上缓解胰岛功能，也无法有效促进胰岛细胞增殖[7]。此外，在传统疗法的长期治疗过程中可能导致低血糖、体重增加及胰岛细胞功能衰竭等诸多不良反应。在防治2型糖尿病时，有效降低血糖同时促进β细胞增殖抑制其凋亡并保护胰岛功能是最佳途径[8]。与传统的胰岛素治疗及降糖药治疗方案相比，GLP-1类似物治疗具有诸多优点，其可使胰岛β细胞有效避免炎症和高糖损害，刺激增殖[9]。采用GLP-1类似物治疗后可显著改善胰岛素抵抗，提高外周组织敏感性，延缓胃排空，抑制食欲，尽可能避免吸收能量物质，有助于控制体重和血糖[10]。此外，GLP-1类似物可有效改善糖化血红蛋白等中长期生化指标，促进胰岛素分泌，避免发生低血糖，改善神经营养，提高抗炎能力，提高长期使用安全性[11]。现阶段，国内外GLP-1类似物多采用化学合成，其纯化相对困难、工艺复杂、价格昂贵、生产成本高，因而常需皮下注射，导致治疗依从性较差。因此临床中亟待研究廉价、高效的GLP-1类似物以对2型糖尿病进行治疗。

现阶段常采用STZ诱导小鼠糖尿病模型应用于2型糖尿病，GLP-1类似物药物可显著控制STZ诱导糖尿病小鼠血糖，改善胰岛损伤[12]。本组研究结果显示，采用构建编码GLP-1序列质粒并转入减毒沙门菌中，后灌胃治疗，结果显示GLP-1重组减毒沙门菌有较理想的降糖效果，改善糖尿病小鼠的体重变化及多食多饮症状。Caveolin-1在机体内以二聚体形式存在，主要存在于小凹结构细胞膜侧，随着研究深入，其糖代谢作用逐渐被解释。有研究显示，Caveolin-1在糖代谢过程中逐渐被广泛认识，敲除Caveolin-1后，小鼠可见脂肪组织萎缩，在正常饮食干预后仍会出现胰岛素抵抗，提示机体胰岛素敏感性与Caveolin-1密切相关[13]。本组研究结果显示，采用GLP-1重组减毒沙门菌治疗后，可有效改善Caveolin-1水平，改善胰岛素抵抗，提高治疗效果。机体自噬可有效利用细胞因子或高分子蛋白与自噬溶酶体和细胞器相互作用，溶解细胞，促使胰岛细胞凋亡，Atg3、Atg12、Beclin-1蛋白有利于自噬体的形成，影响细胞凋亡[14-15]。其中，Beclin-1是机体内重要的自噬相关基因，有效调节并促进溶酶体膜和自噬泡膜相互融合，并与Bcl-1相互作用影响凋亡，进而造成胰岛细胞凋亡[16]。Atg12属泛素样蛋白成员，介导自噬体膜拓展，Mcl-1蛋白与BH3样结构域结合，影响细胞凋亡[17-18]。LC3-1脂溶性反应在Atg3催化下可进一步加速，并与Atg12形成复合物，诱导细胞凋亡[19-20]。本组研究结果显示，GLP-1重组减毒沙门菌治疗后，可有效改善Atg3、Atg12及Beclin-1水平，改善胰岛细胞凋亡，保证胰岛β细胞合成胰岛素及分泌能力，阻滞细胞自噬，实现抑制胰岛细胞凋亡，实现治疗糖尿病；移植GLP-1重组减毒沙门菌可有效调节小鼠体内Caveolin-1、Atg3、Atg12及Beclin-1蛋白水平，进而起到降低STZ诱发糖尿病小鼠体内血糖的作用。

4 结论

采用GLP-1重组减毒沙门菌治疗可有效改善2型糖尿病小鼠Caveolin-1及胰岛β细胞自噬相关因子表达，具有较广的应用价值。但口服重组减毒沙门菌后的体内分布情况及胃肠道环境对减毒沙门菌的影响尚待深入研究，且研究移植GLP-1重组减毒沙门菌后，影响Caveolin-1、Atg12及Beclin1水平的机制，亦有待后续深入拓展研究。