镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠STAT1 mRNA和蛋白表达的影响*

2018-10-17谢鑫陈磊张立德苗嘉芮刘文俊陈靖吴成举

西部医学 2018年10期

谢鑫陈磊张立德苗嘉芮刘文俊陈靖吴成举

(1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110032；2.辽宁中医药大学杏林学院，辽宁沈阳 110032)

信号转导与转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription，STAT)家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6组成。其中STAT1是细胞分化、细胞凋亡、细胞增殖等表达信号通路中最重要的影响因子之一[1-3]。各类细胞因子可以促使STAT1丝氨酸位点磷酸化和酪氨酸磷酸化，磷酸化STAT1进入细胞核后，形成异二聚体或同源二聚体，激活其下游基因表达，产生相应的生物学效应[4-5]。

自发性高血压患者症状主要以头痛和头晕为主，同时伴有耳鸣、心悸等。古代中医学是根据高血压疾病的临床症状来辨证论治的。自发性高血压疾病属于中医学的“眩晕、头痛”等范畴。在《素问至真要大论》中记载：“诸风掉眩，皆属于肝”；《素问标本病专论》“肝病，头目眩，胁支满”，指出眩晕与肝脏关系密切，认为自发性高血压是由于肝阳上亢引起的。镇肝熄风汤具有“镇肝息风，滋阴潜阳”的作用，其治疗肝阳上亢型自发性高血压具有良好的疗效[6]。本实验以自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats, SHR)为研究对象，观察镇肝熄风汤对腹主动脉STAT1蛋白表达和STAT1 mRNA的表达，从而来探讨镇肝熄风汤对肝阳上亢型自发高血压大鼠降压的生物学机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物选取24周龄雄性清洁级SHR大鼠(是基因改良交配自发高血压的世界公认的高血压大鼠，其特点：高血压遗传稳定、易怒、易惊觉等) 60只，采用随机数字表法分成 5 组：模型组(0. 9% 氯化钠溶液)、中药小剂量组(镇肝熄风汤 18g·kg-1)、中药中剂量组(镇肝熄风汤 40 g · kg-1 )、中药大剂量组(镇肝熄风汤 80 g·kg-1)、复方罗布麻组(复方罗布麻混悬液，80g·kg-1), 每组各12 只。选取雄性魏-凯二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)12只设为正常对照组(0.9%氯化钠溶液)。体质量(200±10)g，SPF 级别，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。饲养条件：动物室温度 21～26 ℃，相对湿度46%～56%。

1.1.2 药物与试剂镇肝熄风汤：生龙骨15g(先煎)、生代赭石30g(先煎)、生牡蛎15g(先煎)、炙龟板15g(先煎)、黄芩15g、栀子15g、甘草5g、牛膝30g、丹参20g、川芎15g、生地15g、白术10g、钩藤15g、白芍20g、玄参15g、茯苓10g等，采购辽宁中医大学附属医院药店(中药药材经辽宁中医药大学基础医学院张林老师鉴定，均为合格正品)；药材常规煎煮水提，加水1400 mL (8倍量)，浸泡 30 min，其中生代赭石、生龙骨、生牡蛎、炙龟板先煎 30 min，再加入药方中其余中药药材，煎煮 30 min，煎好后用 10 层纱布过滤，收集药液。复发罗布麻混悬液(亚宝药业集团股份有限公司，国药准字：14022937)。一抗兔抗大鼠STAT1抗体(Abcam Company)；二抗羊抗兔辣根过氧化物酶标记(Horse Reddish Peroxidase, HRP)；STAT1引物：上游5'-GAAGCGAAGACAGCAGA -3'，下游 5'-TGGAAGAGGACGAAGG T-3'，GAPDH引物：5'-TCGGACGCCTGGTTAC-3'，5'-TTCCCATTCTCAGCCTTG-3'， RT-PCR试剂盒和实时定量试剂盒购于TaKaRa(RR014A)；PCR扩增仪(9700 ABI)，核糖核酸提取试剂盒(Triozol Reagent，Invitrogen Life technologies)。

1.2 方法

1.2.1 药物剂量按人与大鼠体表面积比换算给药等效剂量(见陈奇主编《中药药理实验方法》，人民卫生出版社，1994)：大鼠的剂量=X mg/kg×70kg×0.018/200g = X mg/kg × 70kg × 0.018/0.2 kg=6.3 X mg/kg =(172/60)×6.3=18.06 g/kg ，中药低剂量：18 g/kg，中药中剂量：40g/kg，中药高剂量：80 g/kg，浓度分别是1g/ml，2 g/ml，4 g/ml，复方罗布麻片80g/kg，浓度是0.02g/ml，灌胃体积是4 ml/d，早晚各一次灌胃，连续给药45天。

1.2.2 Western Blot 测定取大鼠主动脉弓下段的腹主动脉1～2 cm，PBS冲洗后，每个样本加入总蛋白裂解液，在冰块中操作匀浆，酚试剂法以牛血清蛋白进行蛋白定量，用722分光光度计在波长为650nm的条件下测得OD值，配成同体积同浓度后，加入Running Buffer 100℃沸水中煮5分钟，使蛋白变性煮沸，加样进行分离胶和浓缩胶板中跑胶，取胶放入转印槽中进行转移到硝酸纤维素膜上，取出转印膜，5%脱脂奶粉封闭2h，TTBS清洗2次，加入一抗(1：1000稀释)，加入二抗(1：350稀释)，取出膜，放入平皿中，TTBS冲洗2次，每次5分钟，ECL发光(按说明书操作)。

1.2.3 Real Time RT-PCR 测定每个标本加入TRIzol法抽提总RNA，在冰浴中迅速匀浆，加入氯仿，12000×g 4℃离心15分钟，吸取上清液，加入异丙醇摇匀，12000×g 4℃离心15分钟，弃上清，加75%乙醇1ml，7500×g 4℃离心，弃上清，加Nuclease free water。采用紫外可见光分光光度计测定260nm、280nm OD值，配成同体积同浓度后，加入RT-PCR试剂盒中的试剂(按说明书操作)逆转录合成cDNA，加入Real-time PCR试剂进行实时定量PCR 扩增(按说明书操作)。

2 结果

2.1 Western Blot 结果各组STAT1 蛋白印记、内参GAPDH蛋白印记表达，中药中剂量组和高剂量组、模型组比较表达降低(见图1)；正常组、中药中剂量组和中药高剂量组、模型组比较，STAT1蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0. 01) ，见图2。

图1 STAT1 和GAPDH 蛋白表达Figure 1 STAT1 and GAPDH protein expression

图2 STAT1/GAPDH 灰度值比较Figure 2 STAT1/GAPDH gray value

注：N.对照组；M.模型组;Z1.中药低剂量组;Z2.中药中剂量组;Z3.中药高剂量组;L.复方罗布麻组。与模型组比较，①P<0.01

2.2 Real Time RT-PCR 结果各组腹主动脉血管组织中STAT1和内参GAPDH扩增曲线显示各组STAT1和内参GAPDH扩增效率一致(见图3、图4)；各组腹主动脉血管组织中STAT1和内参GAPDH溶解曲线：显示各组STAT1和内参GAPDH溶解效率一致，见图5、图6；正常组、中药中剂量组和中药高剂与模型组比较，STAT1 mRNA表达明显降低，差异有统计学意义(F=833.093, sig=0.000,P<0. 01)，见图7。

图3 腹主动脉血管组织中STAT1扩增曲线

Figure3STAT1amplificationcurveinthevasculartissueofabdominalaorta

图4 内参GAPDH扩增曲线Figure 4 GAPDH amplification curve of reference

图5 腹主动脉血管组织中STAT1溶解曲线

Figure5dissolvingcurveofSTAT1invasculartissueofabdominalaorta

图6 内参GAPDH溶解曲线Figure 6 reference GAPDH solubility curve

图7 STAT1/GAPDH mRAN 扩增比值Figure 7 STAT1/GAPDH mRAN amplification ratio

注：N.对照组;M.模型组;Z1.中药低剂量组;Z2.中药中剂量组;Z3.中药高剂量组;L.复方罗布麻组。与模型组比较，STAT1 mRNA表达明显降低，①P<0.01

3 讨论

高血压疾病分为自发性高血压(原发性高血压)和继发性高血压疾病，其中90%以上为是自发性高血压疾病，病因尚未明确，临床表现为血压升高为主的独立疾病。自发性高血压疾病发生时机体动脉系统均受到影响，例如使冠状动脉、颈动脉、主动脉、股动脉等发生粥样硬化和纤维化，内膜层和中膜层改变，引起管腔狭窄，影响血液流动，导致组织细胞缺血、缺氧死亡。发生机理有：①血管内膜纤维性增生：血管内膜明显增厚，原始纤维母细胞散在，发生血肿，使动脉狭窄部分变形。②肌肉纤维增生：血管壁中层、平滑肌和纤维组织增生，动脉壁呈同心性增厚，纤维弹力消失引起壁间血肿，在血肿病灶周围存有大量胶原形成。③血管壁中层纤维增生：纤维组织增生、内弹力膜损坏、肌纤维被胶原代替。④促进血管平滑肌细胞凋亡等作用[7-9]。机体血管在受到长期的血压升高刺激时，会造成动脉痉挛，血管内压持续升高，血管内皮细胞和平滑肌细胞初期通过细胞骨架来适应调节，然而最终不能承受血压持续升高和长期的作用，使血管内皮细胞和血管平滑肌细胞间隙增大，血浆蛋白物质渗入血管壁间隙，造成局部血管壁中膜层发生坏死并释出溶酶体酶，引起局部蛋白溶解，增加血管壁通透性。血浆蛋白的渗入和未坏死血管中膜层产生蛋白多糖、修复性胶原纤维。动脉管壁随着长期的血压升高刺激，会出现增厚、失去弹力、管腔狭窄等病理改变[10]。

STAT1是STATs家族中重要的成员之一，活化后的STAT1由两种结构，分子量为：91 kDa STAT1α和84 kDa STAT1β[11-14]。STAT1α 转录激活结构域中包含Y701磷酸化位点和S727磷酸化位点，STAT1β相对STAT1α而言，结构较短，只含有Y701磷酸化位点，从而失去转录激活结构[11-13]。STAT1α和STAT1β都含有SH2结构区、N端结构区和DBD(DNA结合区)。通过STAT1的SH2结构区和Y701磷酸化位点磷酸化后，形成同源二聚体，从而产生生物学作用。大量实验研究表明STAT1具有促进凋亡和增殖等作用[15-19]。本实验研究显示，镇肝熄风汤能够抑制STAT1蛋白和STAT1 mRNA的表达，从而减少腹主动脉细胞凋亡和细胞增殖，降低腹主动脉血管重构。

中医认为自发性高血压其病因病机是由于“阴虚阳亢，肝风内动，肝阳上亢”所致。在《素问五脏生成论》中记载高血压疾病是“头痛巅疾，下虚上实”；《素问至真要大论》中记载：“诸风掉眩，皆属于肝”；防治自发性高血压疾病的主要方法是：“镇肝熄风，滋阴潜阳”；镇肝熄风汤是治疗“肝阳上亢”型自发性高血压疾病主要代表方剂，具有降其上行之血、滋养肝肾；潜阳降逆、柔润熄风、柔肝熄风、清泄肝阳和疏畅肝气。镇肝熄风汤在临床治疗“肝阳上亢”型自发性高血压有良好的疗效。