门冬胰岛素原的酶切及产物分离纯化方法*

周孟能 陈文琼 陈颖 刘永东

(1.乐山市人民医院, 四川 乐山 614000；2.中国科学院过程工程研究所, 北京 100190)

根据国际糖尿病联盟(IDF)统计，2015年全球约4.15亿糖尿病患者，这一人数到2040年预计达到6.4亿[1-4]。随着糖尿病人的数量迅速增加，胰岛素的市场需求量也在逐年增加。目前，每年胰岛素的需求量已经超过了16000kg[5]。

1982年，大肠杆菌表达的重组人胰岛素上市[6-7]。根据不同需要对胰岛素分子进行改造，可以制备出一系列速效或长效的胰岛素类似物。与酵母相比，大肠杆菌具有发酵方法简单，蛋白表达量高，生产成本较低等优点，是优先选择的表达载体。门冬胰岛素是一种速效的胰岛素类似物，在糖尿病治疗中占有重要地位[8-10]。同其它胰岛素类似物一样，门冬胰岛素首先通过大肠杆菌表达为门冬胰岛素原(pro-IAsp)，除含有成熟胰岛素分子的A、B链外，在A、B中间还含有利于蛋白折叠所需的C肽[11-12]。需利用胰蛋白酶和羧肽酶对门冬胰岛素原进行酶切[13-15]，去除C肽才能获得具有生物活性的门冬胰岛素分子。优化酶切过程及酶切后产物的分离纯化对提高门冬胰岛素的质量和产量均有重要意义。

1 材料与方法

1.1 门冬胰岛素原酶切反应 门冬胰岛素原由本实验室自行制备，纯度大于95%，蛋白浓度调整为0.3mg/mL，溶于20mMTris-HCl，pH8.5缓冲液。胰蛋白酶配制：取10 mg胰蛋白酶，加入1mL 1m MHCl溶解，浓度为10mg/mL；取10μL，加入990μL 1mMHCl稀释至0.1mg/mL，分装到10个0.5mL EP管中，-70℃保存备用。羧肽酶B配制：取10 mg 羧肽酶B加入1mL 超纯水溶解，浓度为10mg/mL；取10 μL，加入990μL超纯水稀释至0.1mg/mL，分装到10个0.5mL EP管中，-70℃保存备用。

取该门冬胰岛素原溶液1mL，加入胰蛋白酶和羧肽酶B储液3μL，混合均匀后，室温下孵育。反应进行2 min，10min，30min后分别取150μL反应混合物，加入8μL乙酸终止反应。反相高效液相分析酶切产物，确定最优的酶切条件。

1.2 酶切产物纯化 取门冬胰岛素原溶液20 ml(0.35mg/mL)，在最优酶切条件下进行酶切反应，反应终止后，选择SPFF对酶切后样品进行纯化。层析柱尺寸：1×10cm ID，介质体积8ml；buffer A：50mMNaAc，pH4.0；buffer B：50mMNaAc，pH4.0，1M NaCl。洗脱条件：0-100%B，15min线性梯度洗脱；流速：1mL/min；检测波长：280nm。

1.3 RP-HPLC检测方法[16]选用资生堂Proteonavi柱(4.6mm×250mm,waters2695-2996系统。流动相A：含0.1%TFA的超纯水溶液；流动相B：含0.1%TFA的乙腈溶液。20%-50%流动相B/30分钟；流速：0.5ml/min；采用280nm和214nm双波长检测。

1.4 HP-SEC检测方法 高效凝胶过滤层析(HP-SEC)所用层析系统为AKTA purifer10(GE，美国)。所用凝胶层析柱为superdex peptide30(10×300nm)。上样量为500μL。Buffer：2M urea、20mMTris-HCl、0.15 M Na2SO4、pH 8-8.5；检测波长：214 nm、280nm。

1.5 MALDI-TOF检测方法 通过MALDI-TOF方法检测酶切纯化后产物的分子量。所用仪器为AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF质谱仪。2μL蛋白样品与CHCA在金属板上混合点样，自然干燥后，MALDI-TOF质谱仪进行分子量检测。

2 结果

2.1 门冬胰岛素原的酶切位点分析 门冬胰岛素原的氨基酸从N端开始顺序为前导肽(氨基酸1-3)、B链(氨基酸4-33)、C肽(氨基酸34-68)以及A链(氨基酸69-89)，而成熟胰岛素仅含有A链和B链， AB链通过二硫键连接形成完整胰岛素分子。胰蛋白酶的酶切位点为赖氨酸(K)、精氨酸(R)羧基之后的肽键；羧肽酶B作用位点为C端赖氨酸(K)或精氨酸(R)。根据ExPASyPeptideCutter工具计算，门冬胰岛素原经胰蛋白酶和羧肽酶同时处理，酶切后可能产生如表所示的肽段。可以看出，使用两种酶进行酶切时，可以同时除去N端的前导肽以及C肽，获得完整的胰岛素分子,见图1、表1。

图1 门冬胰岛素原的氨基酸序列Fig 1 The amino acid sequence of proinsulin aspart注：红色表示C肽序列

Table1Analysisofthepositionsofproinsulinaspartdigestedbycarboxypeptidaseandtrypsin

SiteResykting peptied sequencePosition2MK3R25FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER32FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKB chain34TR35R67EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKC peptide68R89GIVEQCCTSICSLYQLENYCNA chain

2.2 反相高效液相分析监测酶切过程 酶切反应2min时，214nm与280nm峰型一致，出峰时间相同，主峰在19.5min，但峰形已不再是单峰(见图2a)。酶切反应进行10min时(见图2b)，280nm处吸收峰发生分裂，吸收主峰位置向后转移至20 min，即门冬胰岛素的出峰位置。同时，在洗脱时间17 min左右出现了新的214nm吸收峰，应为被切下来的C肽的峰。可见随着反应时间延长，主峰出峰时间逐渐向后转移，反应30 min后(见图2c)，主峰已经全部转移至20 min处，推测门冬胰岛素原已经全部转化为门冬胰岛素。对酶切产物进行SDS-PAGE电泳分析，可见在酶切10min时(见图2d)，部分条带从门冬胰岛素原位置转移至门冬胰岛素位置，反应30 min后，门冬胰岛素原几乎全部转化为门冬胰岛素。

2.3 酶切后纯化结果 门冬胰岛素原酶切30min后，调酸至pH4.0终止反应，然后采用阳离子层析介质SP FF进行分离纯化，去除C肽。将酶切样品上样至SPFF柱，采用0-100% B线性梯度洗脱，在280nm有一个洗脱峰(见图3)。收集洗脱峰P，采用高效凝胶过滤柱Superdex Peptide30检测.酶切后纯化样品为单一洗脱峰，表明经过SPFF纯化后，酶切副产物C肽已经被除去，所获得纯化产物的纯度大于95%(见图4a)。MALDITOF检测酶切纯化产物的分子量为5826Da，而门冬胰岛素理论分子量为5825.6Da，两者几乎完全一致(见图4b)。该结果进一步证实，SPFF纯化洗脱峰为门冬胰岛素纯品。分析洗脱峰蛋白浓度，计算纯化过程目标蛋白收率约为30%。

图2反相高效液相及SDS-PAGE监测酶切过程

Figure2RP-HPLCandSDS-PAGEanalysisofenzymedigestionat2min,10min,30min.Lane1:standardofinsulinaspart,lane2,3and4:proinsulinaspartdigestedfor2,10and30min,respectively

注：a、b、c分别为酶切2、10、30min 的反相高效液相图;d.SDS-PAGE电泳结果

3 讨论

人胰岛素分子进入体内后，会形成二聚和六聚体，但起效时间较慢，不利于血糖控制。研究表明，B链靠近C-末端的数个氨基酸，尤其是B28、B29位的氨基酸与胰岛素分子间的聚集关系密切[17]。因此，通过其氨基酸残基而改变胰岛素的药代性质。长效胰岛素如甘精胰岛素，分子聚合能力增强，同时由于等电点变化导致在注射部位沉积，实现胰岛素长时间平稳释放，维持血液中的基础胰岛素浓度[18]；而速效胰岛素的分子性质正好相反，分子间聚合能力降低，起效快，代谢周期短，用以替代体内餐食胰岛素分泌，应对进食后血糖快速升高的情形[19-20]。门冬胰岛素是一种速效胰岛素，是在人胰岛素分子基础上将 B28脯氨酸(P)改为门冬氨酸(D)而成。由于引进阴离子门冬氨酸，电荷排斥作用增强，能阻止胰岛素单体或二聚体的自我聚合，达到迅速起效的降糖作用。目前国内仅有诺和诺德的门冬胰岛素在市场销售，价格昂贵。因此，急需发展门冬胰岛素的制备工艺，开发国内的门冬胰岛素品种。

图3门冬胰岛素原酶切后SPFF纯化
Figure3PurificationprofileofdigestedproinsulinaspartbySPFF

图4 高效凝胶过滤及质谱检测纯化产物Figure 4 SEC (a) and Mass analysis (b) of purified product注：a.高效凝胶过滤及质谱;b.检测纯化产物

人胰岛素和门冬胰岛素等类似物均由A、B两条肽链通过两对二硫键连接形成。早期胰岛素及类似物的生产通过分别制备A、B肽链，然后氧化连接形成胰岛素分子。但这种方法的制备效率很低。胰岛素在人体内首先合成的是含信号肽和C肽的前胰岛素原，随后在胰岛B细胞的作用下降解形成胰岛素分子。受此启发，近年来利用基因重组技术生产胰岛素也是表达含C肽的完整胰岛素原分子，随后通过酶切来获得正确结构恢复胰岛素活性[21]。A、B链中间的C肽能促进胰岛素原在体内及体外的正确折叠，将A、B链表达在同一肽链能极大提高制备效率[22]。另外，为避免大肠杆菌表达重组蛋白时N端出现多余的甲硫氨酸，可在胰岛素原的N端引入胰蛋白酶的酶切位点(MKR)，多余的甲硫氨酸在酶切过程中可随C肽同时去除。

虽然C肽能增加胰岛素原蛋白表达，辅助其正确折叠，但胰岛素原无降糖活性，必须通过酶切去除C肽，因此酶切过程对最终产品的活性及质量至关重要。门冬胰岛素原分子中含多个胰蛋白酶和羧肽酶B的酶切位点，如25位精氨酸(R)位点被切开后会导致B链被切为两截。不同位点邻近氨基酸序列以及空间结构不同，因此酶切反应的难易程度也不完全相同。因此，酶切过程中需要严格控制反应时间，避免产生多余的酶切片段。酶切过程中，酶与底物的比例、作用时间、酶活等都对产物生成有重要影响，作用时间太长会导致B链被切割成两部分，时间太短会导致B链C端含多余的精氨酸，这些酶切产物不仅会降低最终产品比活，同时也给后续的分离纯化带来极大难度。门冬胰岛素原含酪氨酸(Y)和苯丙氨酸(F)，它们所具有的芳香族氨基酸使得门冬胰岛素原在280nm处有紫外吸收，而酶切之后形成C肽不含有上述芳香族氨基酸，酶切之后新生成的C肽在280nm没有吸收，可通过214nm的波长进行监测。酶切后的门冬胰岛素(包含A、B两条肽链)则在两种波长下均有吸收，因此，反相高效液相分析同时采用两种波长监测酶切产物可清楚反应酶切进行程度。对门冬胰岛素原，胰蛋白酶和羧肽酶B采用质量比1：1000时，30min即可酶切完全，同时没有发现B链被切割的现象。离子交换层析具有分离效果好处理量大的优点，并且易于放大。酶切产物经一步阳离子交换层析门冬胰岛素纯度提高至95%，并且收率为30%以上。纯化的门冬胰岛素分子量与理论值完全一致，再次证明了所采用的酶切条件没有产生不完整或含多余氨基酸的肽链。本论文研究结果对门冬胰岛素的规模制备奠定基础，同时对其它胰岛素类似物的生产有指导意义。

4 结论

门冬胰岛素可通过酶切大肠杆菌表达的含多余C肽的门冬胰岛素原获得。这种策略制备过程简单，生产周期短，能降低药物价格。门冬胰岛素原的酶切工艺，获得了完整的门冬胰岛素分子结构，并通过一步离子交换层析获得纯度95%以上的具有正确结构的门冬胰岛素。门冬胰岛素原的酶切及分离纯化工艺可用于指导门冬胰岛素的规模制备。