肾康灵对TGF-β1干预的肾小管上皮细胞的α-SMA和E-cadherin表达的影响

2018-10-16卢小露艾斯郑健

中国卫生标准管理 2018年18期

卢小露艾斯郑健

原发性肾病综合征（PNS）是一种常见儿科肾脏疾病，患病率为16/10万[1]，占小儿肾病综合征的90%左右[2]。PNS也常伴有肾小管间质的变形、萎缩、坏死，最终诱发肾间质纤维化[3]，肾间质纤维化是衡量PNS病情进展关键指标之一[4]。我院选用激素联合肾康灵治疗PNS，有效率达88.89%左右，相比单纯激素治疗，有效率提升显著[5]。本研究以TGF-β1干预的肾小管上皮细胞为实验模型，选取α-SMA、E-cadherin为研究指标，探讨肾康灵改善肾间质纤维化的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验细胞

大鼠肾小管上皮细胞（贝尔曼公司）。

1.2 药品和试剂

肾康灵（福建中医药大学附属人民医院院内制剂，闽药批号Z06106049；由黄芪、山药、三七、绣花针等药物组成）；转化生长因子 -β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）（PEPROTECH）；β-肌动蛋白（b-actin）和上皮钙黏蛋白（Epithelial-cadherin，E-cadherin）的PCR引物（武汉生工生物工程公司）；anti-E-cadherin和鼠抗α-平滑肌肌动蛋白（anti-αsmooth muscle actin，anti-α-SMA）（Cell Signaling）。

1.3 主要仪器

CO2培养箱（Thermo Forma）；PCR扩增仪、凝胶成像系统和转膜装置、垂直电泳装置和转移电泳装置（Bio-Rad）；RNA定量仪（PE生物系统公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养、分组

用含10%胎牛血清的1 640培养液培养肾小管上皮细胞，待生长融合至70时，以每孔板1×104/ml密度种至培养皿内，于37℃、5%CO2培养箱中培养，用0.25%胰酶消化，培养7 d以1 : 2传代。按1×105个/ml密度在25 cm2培养瓶内接种细胞，达到60%左右融合时，使细胞同步化生长24 h后分组。分组情况：正常培养液（空白组）、TGF-β110 ng/ml（TGF-β1组）、肾康灵25 μg/ml+TGF-β110 ng/ml（肾康灵组），分别给药48 h。

2.2 Western bloting法

细胞用预冷的PBS洗3次，加入含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 rpm、10 min离心，提取总蛋白并测定蛋白浓度。蛋白质变性后经电泳、转印、封闭，加入抗α-SMA和抗β-actin的一抗中，4℃孵育过夜；洗膜后再加入二抗，室温孵育1 h；洗膜后加入ECL显色液，静置1 min，用凝胶图象处理系统分析目标条带的光密度值。

2.3 RP-PCR法

总RNA的提取可根据TRIzoI试剂说明书进行，依照逆转录扩增试剂盒操作程序采取cDNA的合成。经对Primers软件的利用，对目的基因引物予以设计。E-cadherin mRNA引物序列为：5’-GCTGGACCGAGAGAGTTTCC-3’，5’-CAAAATC CAAGCCCGTGGTG一3’，长度155 bp。扩增反应条件：95℃进行预变性15 min，95℃变性45 s，95℃退火10 s，60℃延伸30 s，共45个循环，最后一次，72℃延伸5 min。反应结束后，实施专用凝胶成像仪成像。实施Image-Lab软件光密度值统计扫描图像的目的条带，分析比较内参基因和目的基因PCR产物的光密度，得出mRNA的相对含量。

3 统计学处理

4 结果

4.1 Western bloting法检测α-SMA

TGF-β1组α-SMA蛋白的表达相对于空白组明显上调（P=0.018＜0.05），而肾康灵组α-SMA蛋白的表达水平低于TGF-β1组，与之比较，差异具有统计学意义（P=0.023＜0.05）。结果见图1。

4.2 RP-PCR法检测E-cadherin

与空白组比较，TGF-β1组E-cadherin表达降低（P=0.001＜0.05），而肾康灵组E-cadherin表达水平高于TGF-β1组，差异具有统计学意义（P=0.043＜0.05）。结果见图2。

5 讨论

PNS属于祖国医学“水肿”“尿浊”范畴[6]，其根本病机为本虚标实，虚实夹杂[7]。肾康灵具有益肾滋阴、行气化瘀之效。临床研究证实[8-9]，肾康灵可以改善PNS患儿高凝状态，又可以调节机体免疫功能，降低感染率，减少PNS的复发。动物实验发现[5，10]，肾康灵能改善阿霉素大鼠肾脏局部毛细血管通透性与血流动力学，溶解血栓，修复足突，实现保护肾小管间质的效果。PNS频复发、激素耐药或病情长期不能缓解时，可刺激促纤维化相关因子和炎性趋化因子释放，刺激间质成纤维细胞活化，分泌大量细胞外基质成分，形成肾间质纤维瘢痕，最终致肾间质纤维化。TGF-β1是目前最关键的促纤维化因子之一，TGF-β1的表达和肾脏纤维化的严重程度呈正相关性。在激素耐药性肾病病理类型为膜增殖性肾病、局灶阶段肾小球硬化或最终发展为终末期肾病的病例中，TGF-β1增加[11]。转分化过程中，肾小管上皮细胞逐步向间质细胞转化，随着肾间质纤维化的不断进展，作为公认的肌成纤维细胞的特征性标志蛋白α-SMA的表达不断升高[12]。与之相反，E-cadherin广泛存在于正常的肾小管上皮组织中，而当出现细胞损伤的情况时，其含量则不断减少。

本实验中，TGF-β1组α-SMA表达增加，同时E-cadherin mRNA的表达下降，说明其成功诱导了肾间质纤维化的发生。而肾康灵可抑制α-SMA的表达，增加E-cadherin mRNA的表达，证明了肾康灵能够拮抗TGF-β1引起的肾小管上皮转分化，减少TGF-β1对肾小管上皮细胞的损伤。