霍山石斛药材HPLC指纹图谱研究

刘 刚，俞年军，韩荣春，谢冬梅，刘路路，彭代银，何祥林，张淇军

(1.安徽中医药大学 安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012；2.霍山县长冲中药材开发有限公司，安徽 霍山 237266；3.霍山县天下泽雨生物科技有限公司，安徽 霍山 237266)

霍山石斛药材来源于兰科植物霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)的新鲜或干燥茎，主产于大别山区，是安徽省珍稀、名贵、道地药材之一。石斛入药始载于《神农本草经》。其味甘、平，主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳羸瘦，强阴，久服厚肠胃，轻身延年[1]。霍山石斛滋阴清热、益胃生津，其主要有效成分多为多糖、生物碱、氨基酸等物质[2-8]。现行的质量标准多是以多糖和生物碱作为控制指标，只对其单一的有效成分进行定性和定量分析，难以全面反映霍山石斛药材的整体特征[10]。本实验建立了不同产地霍山石斛药材的指纹图谱，目的是研究不同产地的霍山石斛药材质量是否具有差异性，为控制和评价霍山石斛药材的质量标准提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-16型高效液相色谱仪：日本岛津公司；Eppendorf 5810R型离心机：德国Eppendorf公司；AS30600BT系列超声波清洗仪：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；AB135-S型十万分之一电子天平：德国梅特勒公司。

1.2 材料 13批霍山石斛药材来源见表1，均经安徽中医药大学俞年军教授鉴定为兰科植物霍山石斛D.huoshanense。芦丁(111876-201503)、石斛酚(111875-201202)：购自中国食品药品检定研究院；丁香酸(16041910)：购自北京世纪奥科生物技术有限公司；甲醇为色谱纯：瑞典Oceanpak公司；磷酸为分析纯。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-0.2%磷酸水(B)；梯度洗脱(0～40 min，20%～50% A；40～45 min，50%～65% A；45～56 min，65%～70%A)；容积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长240 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 药材烘干粉碎(过60目筛)，精密称取0.5 g，置加塞玻璃瓶中，加入甲醇25 mL，称质量。室温下超声30 min，冷却后称定质量，用甲醇补足损失的质量，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，得供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取芦丁、石斛酚对照品适量，置1 mL溶液瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，溶解，0.22 μm滤膜滤过，得到浓度分别为1.6 mg/mL和0.2 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 称取同一批霍山石斛药材(S1)，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液后，按“2.1”色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以4号峰为参照，分别计算样品中13个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD<1.70%，相对峰面积RSD<2.30%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性实验 称取同一批霍山石斛药材(S1)，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液后，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，分别考察13个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD<1.60%，相对峰面积RSD<1.38%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性实验 平行称取6份同一批霍山石斛药材(S1)，按“2.2.1”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果相对保留时间RSD<1.80%，相对峰面积RSD<2.18%，该方法重复性良好。

2.4 结果与分析

2.4.1 指纹图谱的建立 将13批霍山石斛药材按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，再按“2.1”色谱图条件进行分析，得到各批次霍山石斛药材图谱。将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012)，设S4为参照图谱，选择中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，见图1。时间窗宽度为0.1，采用多点校正方法对色谱峰进行全谱峰匹配，生成指纹图谱共有模式和对照品图谱R，见图2。并计算不同年限霍山石斛与对照图谱的相似度，见表2。

图1 霍山石斛药材标准指纹图谱

图2 13批霍山石斛HPLC指纹图谱与共有图谱R(4.芦丁 7.石斛酚)

S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13RS11 S20.843 1 S30.695 0.906 1 S40.704 0.893 0.981 1 S50.890 0.977 0.883 0.866 1 S60.945 0.939 0.752 0.747 0.956 1 S70.956 0.918 0.768 0.761 0.944 0.978 1 S80.914 0.885 0.842 0.841 0.914 0.906 0.950 1 S90.932 0.924 0.882 0.885 0.941 0.911 0.932 0.954 1 S100.919 0.848 0.816 0.812 0.871 0.872 0.927 0.979 0.949 1 S110.958 0.915 0.830 0.824 0.936 0.948 0.977 0.978 0.967 0.979 1 S120.825 0.858 0.800 0.792 0.863 0.867 0.906 0.940 0.851 0.932 0.933 1 S130.666 0.868 0.983 0.985 0.833 0.697 0.713 0.802 0.875 0.786 0.790 0.726 1 R0.902 0.960 0.927 0.925 0.964 0.924 0.943 0.969 0.979 0.950 0.974 0.917 0.898 1

2.4.2 峰的确认 根据指纹图谱中14个共有峰与对照品溶液色谱图的比对，确认其中4号峰和7号峰分别是芦丁和石斛酚。由图1可知4号峰芦丁出峰时间居中、峰面积适中、分离度好、在各样品中均存在，故选取4号峰芦丁为参照峰。

3 结果分析

3.1 相似度结果分析 由表2可知，栽培品霍山石斛药材(S1～12)相似度计算结果均大于0.900，表明不同产地大棚栽培的霍山石斛药材质量具有较好的一致性。仿野生(S13)霍山石斛药材相似度为0.898，略小于0.900，说明仿野生霍山石斛药材与栽培品霍山石斛药材在质量上差异不大。建议给出相似度阈值为0.900，以0.900为阈值可以将13批样品分为2类，第一类为栽培品霍山石斛药材，第二类为仿野生栽培霍山石斛药材。

3.2 聚类分析 利用SPSS 19.0 统计软件将13批药材中14个共有峰相对峰面积进行聚类分析，选用欧式距离平方作为样品间相似度距离，采用组间连接聚类法进行分析，结果见图3。从图3中可以看出13批霍山石斛药材被大致分为3类，其中S2、S3、S4为一类，S5、S6为一类，S1、S7—S13为一类。结果说明同一产地的霍山石斛药材质量较为均一，而不同产地的霍山石斛药材由于其栽培模式(种源、栽培基质、药材加工方法、采收时间等)的不同而导致其化学成分(1、3、4、6、9号峰所对应的化学成分)含量具有差异性。

3.3 霍山石斛药材共有峰主成分分析 将14个共有峰相对峰面积导入SPSS 19.0软件，以主成分分析为提取方法，提取了3个最主要成分，结果见表3。前3个是最主要的主成分，第一主成分的特征值为6.775，方差贡献率为52.115%；第二主成分的特征值为2.183，方差贡献率为16.795%；第三主成分的特征值为1.226，方差贡献率为9.434%，这3个主成分的方差累计贡献率达到78.344%，这3个主成分已足够代表霍山石斛药材所含化学成分的绝大多数信息。对3个主成分贡献率较高的成分分别是1、3、4、6、9号峰所对应的成分，结合图4的分析结果，认为1、3、4、6号峰所对应的化学成分是影响霍山石斛药材质量的重要化学成分。

图3 13批霍山石斛药材的树状图

3.4 霍山石斛药材载荷图分析 将样品共有峰面积导入SIMCA-P(11.0)中，以SIMAC为主成分分析方法，以PCA on X-block模型对14个共有峰峰面积进行分组[9]。主成分载荷图见图4。由图4可知，指纹图谱中对聚类分析起主要作用的色谱峰为1号峰、3号峰和4号峰，其中4号峰为芦丁，剩下2个峰所对应的化学成分还需要进一步的研究。

4 讨论

随着霍山石斛组培快繁技术的建立，并且成功应用于大规模化的生产，每年能产出数亿株霍山石斛种苗[10]。但是霍山石斛的发展仍然面临着引种种源的混乱,假冒、掺伪药材的收售,相关质量标准不健全等问题。本实验通过建立13批霍山石斛药材HPLC指纹图谱，结合化学计量学方法，以14个共有峰峰面积进行统计分析，指认出其中2个色谱峰，分别是芦丁和石斛酚。实验中还对丁香酸进行了指认，由于在样品中含量仅为0.02%，故未在共有峰中指出。相似度分析结果显示，栽培品霍山石斛药材与仿野生霍山石斛药材的质量较为接近，说明大棚栽培模式下霍山石斛在一定程度上可以替代仿野生栽培的霍山石斛。

表3 13批霍山石斛药材的主成分分析

图4 13批霍山石斛药材载荷图

虽然3年生大棚栽培品霍山石斛和仿野生栽培霍山石斛药材的质量较为均一，但在个别化学成分含量上差异较为显著。在聚类分析和主成分分析中，13批霍山石斛药材被分为3类，这是因为各产地霍山石斛药材中化学成分含量具有差异性，结合主成分分析结果，1、3、4、6号峰所对应的化学成分是影响各批次霍山石斛药材质量的主要因子。因此，下一步实验应指认这4个峰对应的具体化学成分，在霍山石斛药材质量控制上重点考察这4个化学成分。