PPARγ与MSX2在甲状腺肿瘤术后患者骨代谢的作用机制研究

邹 勇，余昌文

(湖北省汉川市人民医院肿瘤科 431600)

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，近年来，由于疾病诊断技术的提高以及公众对疾病认识的改善，大多数地区甲状腺癌发病率呈持续上升趋势[1-2]。手术治疗是目前甲状腺癌常用的治疗方式之一[3]，而术后并发症的预防与治疗，是患者预后的关键因素。骨质疏松症是甲状腺手术术后常见的并发症，可以引起骨折，严重影响患者生活质量与预后。

甲状腺激素对于骨代谢的影响是多通路进行的。适量的甲状腺激素可以通过胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)等途径促进骨形成[4]，而过量的甲状腺激素将影响正常骨代谢，导致骨量丢失[5]。有研究证明，过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)以及wnt通路中的MSX2/Hox8.1蛋白(MSX2)在骨代谢的过程中起到重要作用[6-8]。本文将对PPARγ、MSX2在甲状腺癌术后患者骨代谢中的作用进行探讨，为甲状腺癌术后骨质疏松的研究以及患者的治疗选择提供支持。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2010年1月至2015年12月于本院行甲状腺癌切除术患者纳入治疗组。入组标准：(1)甲状腺癌全切术或次全切术患者；(2)使用稳定剂量左甲状腺素钠片治疗，抑制目标为促甲状腺激素(TSH)<0.5 mU/L者；(3)规律随访，签署知情同意书行相关检查者。排除标准：(1)绝经期女性；(2)伴随骨转移的患者；(3)伴有甲状旁腺损伤的患者；(4)伴随其他骨代谢疾病患者；(5)应用影响骨代谢药物的患者。对照组为1∶1匹配经病理科(由于病情需要进行骨髓穿刺术，术后保留病理切片)诊断排除甲状腺癌，并且通过临床病历系统查询，排除其中具有影响骨代谢疾病、接受影响骨代谢治疗、绝经及肿瘤的患者。治疗组共29例患者，其中男13例，女16例；平均年龄(36.4±6.9)岁；病理分型：乳头状癌17例，滤泡样癌6例，髓样癌5例，未分化癌1例；患者平均左甲状腺素钠片治疗时间(4.62±1.83)个月。对照组匹配患者29例，其中男11例，女18例，平均年龄(31.7±8.3)岁。两组患者使用左甲状腺素钠片的例数与剂量差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器与试剂 自动包埋仪、石蜡切片机、乙二胺四乙酸二钠、4%多聚甲醛、苏木素、伊红、二甲苯、乙醇、盐酸、氨水、PPARγ抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)、MSX2抗体(Abcam公司)、浓缩型二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(北京中山生物技术有限公司)、光密度图像分析仪(德国Leica Q550CW)、Qwin图像分析软件。

1.3方法 两组患者行骨髓穿刺术+活检术，留取骨组织标本，脱钙，石蜡包埋。

1.3.1HE染色流程 切片脱蜡至水化，染色、分化、反蓝：苏木精液染色5 min→自来水洗1 min→1%盐酸乙醇1～2 s→水洗1 min→1%氨水返蓝10～30 s(以镜下观察为准，因多次使用，氨水水平降低，时间增加)→蒸馏水过洗1 min→0.5%～1.0%乙醇伊红液染色2 min。

1.3.2免疫组织化学流程 (1)石蜡包埋的骨组织常规切片(防脱玻片)，60 ℃烤箱l h，静置30 min；(2)梯度乙醇脱蜡水化；(3)抗原修复2 min；(4)3%H2O2封闭内源性过氧化物酶；(5)加1∶100稀释一抗4 ℃孵育过夜；(6)磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗后加生物素化二抗；(7)PBS浸洗后DAB显色；(8)苏木素复染；(9)脱水、封片。阴性对照采用0.01 mol/L的PBS代替一抗，其他步骤不变。

1.3.3图像分析 HE染色：对切片使用全自动图像数字化分析仪进行检测，测量及计算静态参数指标包括骨小梁面积百分数、骨小梁厚度。每张切片测量整个标本，在10×10倍镜下进行。免疫组织化学：在相同光源强度、10×40倍镜下，采用盲法对免疫组织化学图片随机取图，4张/标本。通过Image Pro-Plus(IPP6．0)分析每张图片阳性区域吸光度(A)值，取其平均值代表该样本的A值。

2 结 果

2.1HE切片结果 切片染色后，骨小梁被染成红色，细胞核被染成蓝色，脂肪细胞由于脂滴溢出，表现为圆形空泡，见图1。治疗组脂肪面积明显增多，骨小梁面积及厚度均减少，对照组与其相反，见表1。

图1 骨组织HE染色(10×10倍)

表1 两组骨小梁面积、厚度比较

2.2PPARγ免疫组织化学结果 骨组织中PPARγ蛋白呈棕褐颗粒，主要位于细胞核，因PPARγ蛋白表达量的多少，而呈现棕褐色颗粒多少不同及染色深浅不同。PPARγ蛋白表达量多者，平均积分光密度大，反之则平均积分光密度小，见图2。治疗组PPARγ平均积分光密度为(83.953±10.611)×105，高于对照组的(73.624±10.766)×105，差异有统计学意义(t=2.232，P<0.05)。

图2 PPARγ免疫组织化学结果(10×20倍)

图3 MSX2免疫组织化学结果(10×20倍)

2.3MSX2免疫组织化学结果 骨组织中MSX2蛋白与PPARγ相似，也呈棕褐颗粒并位于细胞核，见图3。治疗组MSX2平均积分光密度为(41.053±9.602)×105，低于对照组的(52.179±9.240)×105，差异有统计学意义(t=1.581，P<0.05)。

3 讨 论

骨髓基质干细胞(BMSC)具有多向分化潜能，在不同诱导体系中可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞[9]。正常骨代谢中存在着成骨和破骨之间的动态平衡，当破骨因素所起作用相对固定时，成骨作用的强弱决定了骨质疏松发生与否。而BMSC可以分化为成骨细胞，也可以分化为脂肪细胞，当成脂肪作用增强时，骨髓腔内脂肪细胞增多，势必引起髓腔内缺血缺氧，从而导致局部骨坏死、骨质疏松、骨折。PPARγ是PPARs的一个亚型，由配体启动后参与调节细胞的分化、增殖及凋亡,是脂肪分化的主要调控因子，可以促进BMSC向脂肪细胞分化[10]。结合本研究中骨组织HE染色结果可以发现，脂肪空泡的面积增加，免疫组织化学中PPARγ的表达增高，推测在甲状腺肿瘤术后患者的骨代谢过程中，BMSC向脂肪细胞分化作用加强，这可能是导致患者后续发生骨质疏松的重要原因之一。

在骨形成的过程中wnt与BMP两大通路起到了重要作用，MSX2可以抑制MSCs向成脂肪方向分化，上调wnt及其配体的表达，从而促进成骨、抑制成脂，双向上调该通路的成骨作用[11]。结合本研究免疫组织化学结果可以发现，甲状腺肿瘤术后患者骨组织中MSX2的表达下降，并且低于对照人群，一定程度上可以推测，患者术后骨代谢的过程中成骨作用受到了抑制。

在甲状腺肿瘤术后患者中，成骨作用受到了一定程度上的抑制，而成脂肪作用则得到了一定的促进，这两方面综合因素可能是患者发生骨质疏松的重要原因，而PPARγ和MSX2在此过程中起到了重要的作用。这两个蛋白表达的改变，提示甲状腺癌术后患者骨质疏松的发生，可能是骨代谢的动态平衡中成脂肪途径过度表达，成骨途径受到抑制的结果。这也提醒临床，患者在甲状腺手术后的治疗，可以从改善患者成脂肪途径和成骨途径动态平衡的药物着手。

当然，由于免疫组织化学检测更倾向于定性研究，近年来电脑软件的发展，可以通过光密度法对试验结果进行分析，但是其结果的精确性可能与绝对的定量研究存在一定程度上的差别。如果通过免疫组织化学法与定量聚合酶链反应(PCR)相结合，结果一致的话，可能更能使人信服。但是由于骨髓活检术所取得的标本量特别少，骨组织含有大量细胞外基质，如钙、胶原等，有效细胞很少，使骨组织mRNA的量以及纯度不能满足进一步检测的要求，故没有进行定量PCR的研究。后续也将进行更准确的定量研究进一步探讨该方面的机制。